组蛋白去乙酰化酶抑制剂逆转白念珠菌耐药性的研究

白念珠菌作为威胁免疫缺陷患者生命的主要病原微生物，其耐药现象日趋严峻，导致治疗的反复性和长期性。探明白念珠菌的耐药机制，研发可逆转耐药性的化合物或治疗手段是临床亟需解决的问题。本研究拟用表观遗传的新思路研究白念珠菌耐三唑类药物的上游机制，寻找逆转耐药性的表观遗传调控剂。首次将临床耐药株，敏感株，实验室诱导耐药株和基因缺失株置于同一研究体系，运用体外药物敏感性测定、小鼠实验动物模型构建、荧光定量RT-PCR、蛋白印迹等技术手段，观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂在体内外对三唑类药物的增效作用，阐明其调控途径，并探讨组蛋白乙酰化修饰与白念珠菌药物敏感性的联系。本研究将为寻找抗真菌药物的新靶标以及表观遗传新疗法的应用奠定一定的实验基础。

白念珠菌是临床最常见的病原真菌，近年来唑类药物耐药菌株不断出现导致治疗的反复性和长期性。课题从表观遗传学角度探讨白念珠菌对唑类药物耐药的机制，为念珠菌耐药机制的研究提供新的线索。本研究在对唑类药物耐药和拖尾现象详细分类分析的基础上，采用体外药物敏感性试验，荧光定量RT-PCR，蛋白印迹和基因芯片等多种技术手段，从不同角度综合分析组蛋白去乙酰化修饰对白念珠菌唑类药物敏感性的影响及其可能的调控机制。研究结果主要体现在以下几个方面：1. HDAC抑制剂TSA对唑类药物体外抗白念珠菌活性有增效作用，表现在抑制白念珠菌的拖尾现象和菌量减少。2. 白念珠菌的HDAC基因HDA1、RPD3在体内外获得性耐药的过程中表达水平均有不同程度的增高，且均在耐药形成过程的早期表达水平即明显增高。3. 与野生株比较，两种主要的HDAC编码基因HDA1和RPD3缺失株的48h MIC有不同程度的降低，伊曲康唑抗真菌后效应时间延长。 4. 基因表达谱结果提示有多个基因的表达可能与HDA1和RPD3有关，涉及应激反应，细胞壁结构，生物膜合成，细胞黏附等多个途径。进一步研究发现HDAC基因表达水平明显增高时，对应的外排泵基因表达水平也较高。HDAC基因突变株的外排泵基因表达低于野生株。含TSA诱导组外排泵功能降低，细胞对药物的蓄积作用增加。5. HDA1或RPD3基因敲除后, H3K23位点乙酰化修饰水平高于野生株,提示二者可直接介导这一位点的乙酰化修饰。有意思的是，本实验还发现部分位点乙酰化水平反而低于野生株，个别位点甚至未见乙酰化修饰。上述结果提示组蛋白去乙酰化酶修饰与白念珠菌的体外抗真菌药物敏感性相关，涉及复杂的多层次的网络调控系统，这种上游调控的影响主要体现在药物作用的早期，药物外排功能的改变是其可能的调控机制之一。本项目的实施有助于从新的途径阐明念珠菌的耐药机制，提出相应的应对策略，找到可逆转耐药性的药物或治疗手段，避免出现无药可治的“超级真菌”的窘境，具有重要的临床意义，同时也可减轻患者的经济负担和社会资源的耗费，具有一定的经济和社会效益。