组蛋白乙酰化修饰对白念珠菌生物膜的影响及机制的研究

Candida albicans is the most common fungus to cause infection. Morbidity and mortality caused by Candida albicans among immunocompromised patients is substantial. Biofilm is one of the most important pathogenic and drug resistant mechanisms in Candida albicans. In our recent study supported by National Natural Science Foundation of China，we found histone acetylation（an important epigenetic modification） could regulate azole resistance in Candida albicans. This research based on the new ideas of epigenetic will try to study on the mechanism of Candida albicans biofilm formation in the upper reaches, to seek reversal of drug resistance by epigenetic regulation agents. The relationship between histone acetylation and biofilm formation of Candida albicans will be explored comprehensively from different aspects of protein and gene expression by the methods of post translational proteome, real-time quantitative RT-PCR, in vitro micro-dilution test, western blot, laser confocal microscopy, gene knockout and bioinformatics analysis et al., studying for the detailed information of the modification sites and how these modifications govern related gene expressions, seeking for the specific histone deacetylase inhibitors, and illustrating the regulation way of the histone deacetylase inhibitors against biofilm formation and drug resistance. This study will be meant to find novel target for antifungal drugs and provide an experimental basis for the application of new epigenetic therapeutic approach.

白念珠菌是威胁免疫缺陷患者生命的主要病原微生物，生物膜的形成是其重要的致病机制和高度耐药机制之一。我们在近期结题的国家自然科学基金资助的研究中发现组蛋白乙酰化修饰（一种重要的表观遗传修饰方式）对白念珠菌的唑类药物敏感性有调控作用。在此基础上，本研究拟用表观遗传的新思路研究白念珠菌生物膜形成的上游机制，寻找逆转耐药性的表观遗传调控剂。首次从蛋白、基因水平等不同层次综合探讨组蛋白乙酰化修饰与白念珠菌生物膜的关系及其作用机制，利用修饰蛋白组学、 荧光定量RT-PCR、药物敏感性测定、蛋白印迹、激光共聚焦显微镜、基因敲除和生物信息学分析等技术手段研究影响白念珠菌生物膜形成的组蛋白乙酰化修饰的具体位点及其干预相关基因表达的机制，寻找修饰此位点的组蛋白去乙酰化酶，并阐明其拮抗生物膜形成及药物耐受的调控途径。为寻找抗真菌药物的新靶标以及表观遗传新疗法在抗真菌领域的应用提供理论依据和实验数据。

白念珠菌是威胁免疫缺陷患者生命的主要病原微生物，生物膜的形成是其重要的致病机制和高度耐药机制之一。课题从表观遗传学角度探讨白念珠菌生物膜形成的上游机制，寻找逆转耐药性的表观遗传调控剂。首次从蛋白、基因水平等不同层次综合探讨组蛋白乙酰化修饰与白念珠菌生物膜的关系及其作用机制，利用蛋白组学、修饰蛋白组学、 荧光定量RT-PCR、药物敏感性测定、蛋白印迹、激光共聚焦显微镜、基因敲除，Chip-seq和生物信息学分析等技术手段研究影响白念珠菌生物膜形成的组蛋白乙酰化修饰的具体位点及其干预相关基因表达的机制。研究结果主要体现在以下几个方面：1. 在白念珠菌生物膜形成过程中，有多个蛋白和乙酰化修饰位点出现不同程度的改变，上调蛋白分布较多的亚细胞结构为nucleus和plasma membrane上，下调蛋白分布较多的亚细胞结构为nucleus和cytoplasm；上调蛋白富集最多的通路为Nitrogen metabolism，下调蛋白富集最多的通路为Metabolic pathways。上调和下调乙酰化修饰分布较多的亚细胞结构为cytoplasm；上调修饰富集较多的通路为Citrate cycle（TCA cycle）、Biosynthesis of secondary metabolites等，下调修饰富集最多的为Ribosome。2. 生物膜形成过程中，组蛋白H3表达量上调，但H3K18位点乙酰化修饰水平反而下调; 此外，体外人工诱导白念珠菌耐氟康唑菌株，发现浮游状态下的菌株，随着氟康唑耐受浓度增加，H3K18乙酰化修饰水平下调。提示不管白念珠菌处于悬浮状态还是生物膜状态，随着白念珠菌耐药水平上升，H3K18乙酰化修饰水平下调。通过Chip-Seq寻找H3K18乙酰化修饰下游调控基因，结果提示H3K18乙酰化修饰直接调控生物膜形成相关基因和糖代谢等重要通路。3. 在生物膜形成过程中，10种组蛋白去乙酰化酶都出现基因表达上调，均在72h上调最明显；组蛋白去乙酰化酶Hst2在1.5h和72h表达上调，Hos3在12h、24h、72h表达下调；去乙酰化酶HDA1，RPD3突变株的生物膜在结构和活性方面均较野生株差。提示组蛋白去乙酰化酶可影响白念珠菌生物膜的形成。本课题的实施有助于从新的途径阐明念珠菌生物膜形成的机制，对临床此类感染的精准防控提供新的思路，具有一定的经济和社会效益。