乳酸乳球菌N8基因组精简与高产nisin生物合成的适配微调及功能肽的修饰研究

Lactococcus lactis N8 is a recognized as food-grade microorganism which can produce natural antimicrobial peptides - nisin. Synthetic biology technology can be used to streamline the genome for constructing the optimal genomic cell chassis. The synergistic effect and the stable inheritance of product regulatory pathway can be achieved through combining the efficient promoter and the functional module adapter. The application of the food-grade L.lactis can be expanded, especially in terms of safe food and pharmaceutical products. This project intends to use synthetic biology techniques to reduce L. lactis genome. With the knockout of immune tolerance related genes irpT and feuD and the over-expression of immunity genes of nisI and nisFEG may improve nisin production in the cell chassis. Deletion of PKSs gene clusters such as pksC, pksB, pksA in L. lactis N8 and the genetic complement of those genes, respectively to reveal the coordinate regulation mechanism between synthesis of ribosomal peptide Nisin and non-ribosomal peptide PKSs. Finally achieving optimized genome chassis strains with high yield of nisin to provide reliable support to improve the level of industrialization of nisin and meet the needs of food preservatives of antimicrobial peptides in China. Using an optimized genome chassis with high nisin productivity could modify heterologous functional peptides in vivo efficiently, which can provide a new technical method to increase the stability and yield of drug based functional peptides.

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）N8是公认食品级微生物,它可产生天然抗菌肽-乳链菌肽（Nisin）。利用合成生物学可精简基因组构建最优基因组底盘，通过与高效启动原件及功能模块适配可实现产物调节通路的协同及稳定遗传，可拓宽其在安全食品和重要医药等领域发挥更重要作用。本项目拟利用合成生物学技术手段，连续删减N8基因组构建底盘菌株；对nisin免疫耐受相关基因irpT和feuD敲除及nisI、nisFEG过表达微调N8免疫耐受能力，提高底盘细胞nisin产量；对N8菌中PKSs基因簇中pksC、pksB、pksA敲除及遗传互补，研究核糖体肽nisin与非核糖体肽PKSs合成之间协调机制。最终获得nisin高产最优基因组底盘菌株，提高nisin产业化水平，满足我国食品业对防腐剂需求。探索利用高产nisin优选底盘对外源功能肽有效环化修饰，为新型稳定性好生物多肽药物开发提供新技术。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是公认的食品级微生物，它可以产生天然抗菌肽-乳链菌肽（Nisin）。利用合成生物学手段可精简乳酸乳球菌基因组从而构建最优底盘菌株，随后通过与高效启动元件及功能模块适配，可实现产物调节通路的协同及稳定遗传。通过阐明乳酸乳球菌多重压力耐受性机制，可拓宽其在安全食品和医药等领域的应用。本项目基于合成生物学技术手段成功建立且优化了乳酸乳球菌删减方法并对乳酸乳球菌基因组进行连续删减，构建的底盘菌株达到了目前国际上最大的精简程度；通过转录组的数据分析成功构建了乳酸乳球菌的强启动子元件文库；通过对影响乳酸乳球菌nisin耐受性的基因以及片段（feuD，irpT 和prophage-related fragment）的研究，成功构建了高nisin耐受性的底盘菌株。此外，我们探索了胞内nisin 合成系统对外源功能肽的有效修饰，构建了外源多肽类药物表达质粒pG-PSA，并且在乳酸乳球菌N8中成功的表达了 PSA也检测到环化后的PSA保持了特定的酶活；我们对乳酸乳球菌N8中PKSs基因簇中的pksC、pksB、pksA基因进行了敲除及遗传互补，研究了核糖体肽nisin与非核糖体肽PKSs之间的协调机制；我们还探索了2，3 -丁二醇脱氢酶的调控基因以及证明了乳酸菌生产2，3-丁二醇可能性；我们还利用 L. lactis N8共表达食品安全级抗菌肽nisin Z和leucocin C，扩大乳酸菌的杀菌范围。本项目最终获得的最优基因组底盘菌株减小了代谢负担，这对于nisin的生产以及高附加值的外源蛋白的表达是极为有利的，奠定了乳酸乳球菌作为食品安全级细胞工厂的重要基础；成功利用乳酸乳球菌实现外源功能肽的胞内有效环化修饰，为新型稳定性好的生物多肽药物开发提供新技术。本项目成果的推广将拓宽乳酸菌的安全食品和医药等领域的广泛应用。