氟化物通过转录因子FoxO1调控釉基质蛋白酶表达影响氟牙症发生的分子机制研究

Hydrolysis blocking and removing delay of enamel matrix proteins were major cause of dental fluorosis. MMP20 and KLK4 are responsible for enamel matrix proteins hydrolysis. We found that: fluoride could decreased MMP20, KLK4 and FoxO1 mRNA expression. And after siRNA interference of FoxO1 gene, MMP20 and KLK4 mRNA reduced. In attention, bioinformatics search found that there are FoxO binding sites in MMP20 and KLK4 gene promoter regions. All of those suggest that fluoride may reduce FoxO1 expression or activity, which influences the expression of MMP20 and KLK4 and cause dental fluorosis. In this study, FoxO1 gene conditional knockout mice, microscopic hardness measurement, scanning electron microscopy and molecular biology techniques will be used to observe the effects of FoxO1 on enamel mineralization, the regulating mechanism of FoxO1 on MMP20 and KLK4, the influence of fluoride on enamel mineralization of conditional knockout mice and the effect of fluoride on FoxO1 combining with MMP20 and KLK4 gene promoters. Our research will reveal the effect of FoxO1 in dental fluorosis and provide theory basis for preventing dental fluorosis and reasonable application of fluoride.

釉基质蛋白水解障碍和清除延迟是氟牙症发生的主要原因，釉基质蛋白水解是由MMP20和KLK4催化完成。我们发现:氟下调MMP20、KLK4和转录因子FoxO1表达；用SiRNA干扰FoxO1基因后，MMP20和KLK4 mRNA表达下调。生物信息学检索发现在MMP20和KLK4基因启动子区有FoxO结合位点。由此推测：氟可能通过下调FoxO1的表达或活性影响MMP20和KLK4表达，导致氟牙症。本研究拟通过氟牙症大鼠和细胞培养，观察氟对FoxO1表达的影响。通过基因过表达观察FoxO1对MMP20和KLK4的调节机制，揭示FoxO1在氟牙症发生过程中作用，为预防氟牙症和合理应用氟化物提供理论依据。

背景：目前认为过量氟可使釉基质蛋白的降解和清除障碍，进而影响钙盐沉积，导致氟牙症发生。基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase 20，MMP20）和丝氨酸蛋白酶（Kallikrein-related peptidase 4，KLK4）是釉质发育中的关键酶。研究显示过量氟下调KLK4或MMP20表达，可能是导致釉基质蛋白降解和清除障碍的主因。转录因子Foxo1是近年来生命科学研究的热点。成釉细胞中Foxo1基因敲除后，小鼠下颌切牙出现釉质矿化不全。然而，Foxo1与MMP20和KLK4之间是否存在着调节关系，以及这种关系在氟牙症发生中的作用目前并不清楚。.目的和意义：通过体内外实验观察过量氟对Foxo1表达影响，并探究Foxo1对MMP20、KLK4的调节机制，揭示Foxo1在氟牙症发生中的作用，增加在分子水平对氟牙症发病机制的认识，为预防氟牙症发生提供理论依据。.方法：通过饮水给氟建立氟牙症大鼠模型及氟化物干预体外培养的成釉细胞样细胞系LS8，利用免疫组化，Western blot等观察过量氟对Foxo1、KLK4和MMP20表达影响；通过Foxo1过表达慢病毒转染LS8细胞调节Foxo1过表达，利用qRT-PCR和Western blot观察Foxo1过表达对氟诱导的MMP20和KLK4表达影响；利用双萤光素酶报告基因实验评估Foxo1对KLK4启动子区转录活性的调控作用。.结果：在氟牙症大鼠模型中，FoxO1在大鼠下切牙成釉器细胞层的表达具有时空特异性：在分泌期，Foxo1主要表达于成釉细胞胞浆；在转化期和成熟期，Foxo1成釉细胞胞核表达明显增强。过量氟导致分泌期成釉细胞胞浆阳性染色减弱，转化期和成熟期成釉细胞胞核阳性染色减弱。qRT-PCR和Western blot结果显示，实验组大鼠下切牙成釉器细胞层Foxo1、MMP20和KLK4表达均显著下降。在LS8细胞中，过量氟导致Foxo1、KLK4表达显著下降，但对MMP20表达无明显影响。进一步研究显示Foxo1过表达上调氟诱导的KLK4表达，对MMP20表达无明显影响。双萤光素酶报告基因实验结果显示Foxo1过表达可以上调KLK4启动子区的转录活性。.结论：过量氟通过下调Foxo1表达并抑制其活性，减少Foxo1下游基因KLK4表达，从而影响釉基质蛋白的降解和清除，促进氟牙症的发生。