GMDTC驱镉作用的分子机制研究

Cadmium leads to occupational poisoning and environment pollutions has become one of the most serious and widespread problems in China. It’s reported that around 10% of rice excessive the National Limit on cadmium in China. So everyone could become potential victim of cadmium harm. Cadmium can enrich in kidney gradually which causes renal cells damage and osteoporosis, finally leads to itai-itai disease and even cancer. Until now there is no specific clinical drug for cadmium treatment. GMDTC is a special effect cadmium excretion which is invented by the applicant and has been granted patents. GMDTC has been accomplishes the synthesis process, quality standards and pharmacodynamics according to class I new drugs by the support of a major new drug project creation of Guangdong Province.The results show that GMDTC can specifically remove cadmium in kidney cells and the toxicity is very low.Indirect evidence suggests that cadmium-driven mechanisms are associated with the use of glucose reabsorption pathways, including SGLT2 or GLUT2 transporters.This project determine the crystal structure and mixing ratio through the preparation of GMDTC-Cd crystals.Find the directly demonstration of the cadmium driven mechanism of GMDTC's glucose theory by Genetically engineered cells that are Lowly expressed the SGLT2 or GLUT2.The results shows great significance for elucidating the distribution, metabolism and transformation of GMDTC in vivo, as well as improving the pharmacological and toxicological evaluation of GMDTC, so as to effectively solve the key problems of GMDTC registration and clinical application.

我国镉引起的职业中毒、环境污染事件频发，10％的大米镉超标，每个人都成为镉污染的潜在受害者。进入人体的镉逐渐在肾细胞内富集，导致肾损伤、骨质疏松，引起“痛痛病”和癌症，但目前“无药可救”。GMDTC是本项目申请人研制出的特效驱镉剂，已获发明专利和广东省重大创制新药项目资助，按I类新药完成合成工艺、质量标准和药效学等工作。结果表明GMDTC能特异性清除肾细胞内的镉，毒性很低。前期研究发现，GMDTC的驱镉作用机制可能与其利用SGLT2-GLUT2偶联的葡萄糖重吸收途径有关。本项目通过构建GMDTC-Cd晶体，确定GMDTC-Cd配合物的结构，通过CRISPR /Cas9制作的SGLT2 或／和GLUT2低表达的基因修饰细胞和动物试验，找到GMDTC的利用葡萄糖重新收途径驱镉的直接证据，可进一步阐明GMDTC的驱镉作用分子机制，掌握其药理毒理和代谢特点，为加快GMDTC的研发应用奠定基础。

本研究目的是确定GMDTC-Cd配合物的结构，通过CRISPR/Cas9制作的SGLT2或／和GLUT2低表达的基因修饰细胞和动物试验，找到GMDTC的利用葡萄糖重新收途径驱镉的证据，阐明GMDTC的驱镉作用分子机制，掌握其代谢特点，为加快GMDTC的研发应用奠定基础。. 结构研究表明，UV-VIS光谱显示了GMDTC与镉反应形成GMDTC-镉络合物的能力,GMDTC与Cd2+的络合比为2:1。细胞研究显示，在预防试验中，镉与GMDTC共同处理可增加HK-2细胞活力并降低镉诱导的毒性。在治疗实验中，GMDTC可使镉中毒HK-2细胞的细胞活力增加，表明GMDTC可以减轻镉引起的细胞内镉积累引起的毒性。基因敲除试验，使用CRISPR/Cas9技术在HK-2细胞中实现了GLUT2的62.9％（目标1），36.4％（目标2）基因敲除效率和27.0％（目标2）SGLT2基因敲除效率。在GMDTC治疗镉中毒细胞试验中，与对照组比较，单基因和双基因敲除细胞模型中的细胞活力均降低，这表明SGLT2和GLUT2基因敲除后，GMDTC可能不会进入镉中毒细胞和/或GMDTC-镉的复合物无法从细胞中排出。在SGLT2或GLUT2蛋白载体的抑制下，GMDTC与Cd共同处理后的HK-2细胞活力均显着降低，这表明由于葡萄糖转运蛋白的抑制，GMDTC不能进入细胞形成复合物，随后复合物会从细胞中排出，导致GMDTC抵抗镉引起的细胞毒性的能力下降。利用CRISPR/Cas9技术构建GLUT2基因条件敲除小鼠C57BL/6J-Slc5a2 em1cyagen，4雄2雌，但未能繁育出小鼠，无法开展基因敲除小鼠试验。研究表明，GMDTC通过防止镉在肾细胞中的蓄积以及通过葡萄糖重吸收途径去除细胞内的镉而保护免受镉诱导的毒性。代谢试验结果：GMDTC的Cmax为给药结束即刻即0.133 h。平均消除半衰期（t1/2）在0.54至0.65小时之间。清除率介于1-3L/h/kg，和大鼠肝血流量相比，GMDTC是一个中等清除率的受试物。平均Vz值（1.31至2.08 L/kg）说明GMDTC为较均匀分布的受试物。GMDTC半衰期短，在体内无需蓄积，并且雌雄之间并无差异。. 本研究数据为GMDTC申请临床试验批件提供有利的数据支持，并成功获得2项发明专利和发表2篇文章，并获得新药临床试验批件。