甾醇C-4去甲基多酶体系中Erg28p蛋白的生物学功能及作用机制研究

Synthesis of sterol relative metabolites is an important physical function of cell membrane in yeast, which have gained wildly concerns from current researches. C-4 sterol demethylation reaction is a key step in ergosterol synthetic metabolism, in which Erg28p plays an vital role in the conformation of C-4 sterol demethylation multi-enzymes complex, but the indeed mechanism needs to be further explorated. In our previous studies, we tried to heterologously express the four subnuits of this multi-enzyme complex, but only ERG26 was succeed. We speculate that the endoplasmic reticulum and the interation with other subunits may influence the cellular location and post-translation of the protein. Based on the supposition above, this project is assumed to research on the biological function and molecular mechanism of Erg28p in ergosterol synthetic metabolism， especially focus on the assistant role in the formation of C-4 sterol demethylation complex and the influence of the expression level, cellular location and catalytic ability of Erg25p（SMO）,Erg26p（3-HSD/D）and Erg27p(3SR).The key acting sites of Erg28p is supposed to be further explorated. All the rusults in this project will provide theoretical basis for setting up C-4 sterol demethylation multi-enzymes system in the synthesis of active intermediate products with high value in sterol synthetic metabolism.

甾醇类物质的合成是酵母细胞膜的的重要生理功能，也是目前合成生物学领域的研究热点。C-4甾醇去甲基反应是麦角甾醇合成代谢的关键步骤，其中Erg28p蛋白在形成C-4去甲基多酶催化体系中发挥重要功能，但目前作用机制尚未明确。前期研究中，我们尝试在大肠杆菌中异源表达C-4去甲基多酶体四个亚基发现仅Erg26蛋白被成功诱导，猜测细胞的内质网膜结构及与其他亚基的相互作用可能影响蛋白的细胞定位及翻译修饰。基于上述设想，本项目拟以研究Erg28蛋白在麦角甾醇合成代谢中的生物学功能及相关分子机制为研究对象，集中研究Erg28p蛋白在辅助C-4甾醇去甲基多酶体系形成中的生物学功能及其对Erg25p（SMO）,Erg26p（3-HSD/D）及Erg27p(3SR)蛋白的表达水平、细胞定位及催化能力的影响，并进一步探索Erg28p蛋白的关键作用位点，为建立C-4甾醇去甲基多酶体系合成甾醇活性中间体提供理论基础。

本项目针对甾醇生物合成过程的关键通路——麦角固醇合成通路为研究对象，重点考察甾醇母核C-4位去甲基反应中甾醇C-4位去甲基酶复合体中支架蛋白Erg28p蛋白的生物学功能、分子作用机制及关键作用位点，为后续建立甾醇的体外转化反应体系建立理论基础。. 项目首先利用Cre-loxP 系统建立了ERG28基因敲除的酿酒酵母细胞模型（BY4741/ΔERG28），考察了野生菌和敲除菌的生长表型，结果显示ERG28基因的敲除显著抑制了酿酒酵母的生长速率。随后利用气相质谱联用（GC-MS）比较了BY4741/ΔERG28菌株细胞膜上麦角固醇合成代谢组分及含量的差异，结果显示敲除菌株麦角甾醇含量较野生菌显著降低（42.85%），并有多种麦角固醇前体累积；在回复表达菌株BY4741/ΔERG28-pYES2-ERG28中，麦角甾醇代谢通路的前体累积物质被重新去除，终产物麦角甾醇得到有效累积，从而证实Erg28p蛋白参与酿酒酵母麦角甾醇合成代谢。. 进一步考察了Erg28p蛋白在影响甾醇C-4位去甲基反应及甾醇合成过程的分子作用机制，分别构建了GFP与Erg25p，Erg26p，Erg27p及Erg28p的融合表达载体，通过荧光共聚焦实验初步证实Erg28p蛋白辅助C-4脱甲基多酶体系中其他亚基的内质网膜的定位，从而间接影响C-4甾醇脱甲基反应，导致麦角固醇合成路径的阻断。. 最后，为明确Erg28p蛋白在影响C4-去甲基酶复合物折叠中的关键作用位点，分析了Erg28p蛋白在内质网膜上的跨膜折叠形式，并根据预测结果构建了一组Erg28p蛋白的连续截短表达载体，分析了含有ERG28突变体的重组菌株甾醇代谢合成组分及含量，发现Erg28p中136-273区段的氨基酸缺失显著影响麦角固醇合成，造成甾醇C-4位去甲基过程中间代谢产物的累积。进一步利用同源比对等多种生物信息学分析，预测并证实高度保守的63LS/QARTFGT/LWT72基序是Erg28p蛋白在甾醇C4去甲基反应过程中的关键作用位点，蛋白三维模建进一步确认该基序的缺失会显著影响Erg28p蛋白的空间折叠。. 小结，本项目阐明了Erg28p蛋白在甾醇C4-去甲基酶复合物的生物学功能、作用机制及关键作用位点，为后续甾醇生物转化体系的开发奠定了理论基础。