苯并咪唑类杀菌剂新分子靶标基因的结构与功能分析

30多年来的大量研究一致认为苯并咪唑类杀菌剂作用于与真菌细胞分裂分化有关的β-微管蛋白，阻止细胞分裂，抑制菌体生长。β-微管蛋白基因发生点突变引起植物病原真菌产生抗药性。然而，项目申请人不仅在国际上首次发现我国引起小麦赤霉病的禾谷镰孢菌对该类代表性杀菌剂多菌灵产生了高水平抗药性，而且证明抗药性表型和抗药机制也不同于国际上已经报道的其他真菌。自项目申请人首次报道赤霉病菌对多菌灵的抗药性与β-微管蛋白基因无关，而是与赤霉病菌特有的一种新微管蛋白基因突变有关以来，新微管蛋白基因正在成为国际上新的研究热点。本项目拟通过构建新微管蛋白基因缺失和点突变体文库，分析其与多菌灵的亲和性及对生长、发育、繁殖和致病性的影响，分析功能域；通过RT-PCR和双色荧光分子标记及微管蛋白的原核表达和纯化，分析新微管蛋白基因与β-微管蛋白基因表达互作关系及其进化的生物学意义。

本项目于2010年研究工作已经启动。在前期2年的研究基础3名博士和3名硕士经过3年的研究，超额完成了本项目设定的研究内容和考核指标，共获得国家科技进步二等奖2项，发表SCI源论文6篇（原考核指标3篇），中文核心期刊3篇（原考核指标2篇），国家授权发明专利1个，培养了3名硕士和6名博士；作国际学术报告5次，国内学术报告13次。. 构建了禾谷镰孢菌亚洲种无遗传标记的新微管蛋白点突变体文库和模建新微管蛋白立体结构发现：编码该蛋白的新微管蛋白基因三联密码子突变导致禾谷镰孢菌亚洲种对苯并咪唑类杀菌剂如多菌灵的抗药性；通过原核表达，在体外进行了该种对多菌灵不同敏感性水平菌株的微管蛋白基因家族4个成员α1-、α2-、β-、新-微管蛋白分别聚合成由α1-/α2和β-/新-微管蛋白组成的异二聚体与多菌灵结合的动力学方程，进一步证实由于新微管蛋白的点突变导致其编码蛋白的空间构想发生改变，进而降低了其与药剂结合的亲和力；构建的双色荧光标记突变体的显微分析表明：β-、新-微管蛋白均为药剂的作用靶标，但是在生物进化过程中，这两个蛋白角色存在精确分工，前者在分生孢子、子囊孢子、分生孢子芽管和丝状菌丝阶段表达水平平稳，而后者表达水平由低到高的顺序为：分生孢子＜子囊孢子＜丝状菌丝＜分生孢子芽管，新微管蛋白侧重于在致病性、菌丝生长和产孢方面发挥主导作用；新微管蛋白的点突变还导致合成小麦赤霉病菌毒素的Tri 基因族表达上调，导致抗药性菌株DON类毒素污染小麦籽粒程度显著加重（2倍），是抗药性基因多功能性的表现。