MicroRNA-137靶向调控基因CUL4A和CLPX在多发性骨髓瘤耐药中的作用及机制研究

本课题是前期工作的延续和深入。我们前期研究发现，30%的多发性骨髓瘤（MM）存在染色体1p21的缺失，是独立的预后不良因素，提示位于1p21的关键基因可能参与了MM的发病。但我们及其他研究组织未能在此位点发现发挥关键作用的蛋白质编码基因。搜索NCBI MapView数据，发现5个microRNA定位于1p12-p21，其中定位于1p21的microRNA-137在MM中的表达水平比正常浆细胞低，并且具有预后意义。生物信息学预测发现microRNA-137调控两个与MM有关的基因：CUL4A和CLPX，前者参与DNA的损伤修复，后者参与非折叠蛋白的降解。MicroRNA-137可能通过调节CUL4A和CLPX参与了MM对细胞毒药物和蛋白酶体抑制剂的耐药。本课题拟系统研究microRNA-137靶向调控CUL4A和CLPX基因在MM耐药中的作用及机制，为靶向治疗和逆转耐药策略奠定基础。

多发性骨髓瘤（mμltiple myeloma, MM）是中老年人群常见的血液系统肿瘤，探索MM耐药的机制、确定新的治疗靶点，寻求新的干预政策对于提高MM的疗效具有特殊的重要性和紧迫性。MicroRNA是一类长度在22nt左右的非编码RNA基因产物，通过与mRNA的3’UTR结合而介导翻译水平的调控。研究表明某些miR-137在结直肠癌、肺癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤的发生发展中起着重要的作用。本研究旨在探讨多发性骨髓瘤中miR-137表达水平，并探讨miR-137在多发性骨髓瘤耐药中的作用。.检测43例MM初治患者骨髓标本，5株骨髓瘤细胞系(NCI-H929、U266、KMS11、OPM2、RPMI8226)，以及正常供者骨髓标本。经磁珠分选患者标本CD138+细胞，提取RNA，采用实时定量PCR检测miR-137的表达情况；提取DNA，经亚硫酸氢盐处理后分别进行甲基化特异性PCR、亚硫酸盐测序和焦磷酸测序的方法检测MM细胞系和MM病人标本中CD138+细胞中miR-137的甲基化状态。分析其甲基化状态与miR-137表达的关系。将慢病毒包装的miR-137高表达载体感染骨髓瘤细胞系NCI-H929，获得稳定细胞系后，使用流式细胞术检测细胞凋亡、CCK-8法增殖、药物敏感性以及染色体不稳定性，并研究确定其靶基因。.结果表明， 相比正常供者，miR-137在MM细胞系和患者标本中表达明显降低，且与患者预后密切相关。其启动子区域甲基化相关检测显示在MM细胞系和MM患者标本CD138+细胞中Mir-137启动子区域存在明显甲基化。通过Cck-8, 克隆形成试验以及凋亡实验等表明，在骨髓细胞系中miR-137过表达可以抑制细胞增殖、增加药物敏感性；CGH-array 分析 显示miR-137过表达可降低NCI-H929细胞的染色体不稳定性，如1q21扩增, 1p22.2, 14q, 17p13缺失。体内实验也证实miR-137过表达可减少小鼠荷瘤体积以及增加小鼠生存时间。进一步研究发现，miR-137是通过靶向AURKA在MM耐药和染色体不稳定性上发挥作用的。.结论：miR-137在MM中表达明显降低，并且其靶向的AURKA表达增高，使得MM易发生耐药和染色体不稳定。