蛋白三维结构解析疫霉菌RXLR效应分子抑制植物程序性细胞死亡的机制

Phytophthora pathogens deliver hundreds RXLR effectors into the plant apoplast to promote infection by modulate plant defense circuitry and enable parasitic colonization. Understanding of the virulence mechanisms will promote the development of novel disease control strategy. The previous functional research shows that most P.sojae RXLR effectors can inhibit plant programming cell death(PCD), but the mechanism is still unknown. We have found that the PCD inhibition of RXLR effectors depends on its W-motif, and some amino acids located on the second α-helix play key roles. The project intends to screen host target proteins of Avh5, which protein structure has been reported; The establishment of protein interaction model depends on revealing the structures of the target protein and W-motif mutants by nuclear magnetic resonance(NMR) spectroscopy; Comparative analysis of the relationship of W-motif and its structure changes, and interactions with host targets, will help understanding the mechanisms of PCD inhibition. The results will provide scientific basis for the development of novel control strategies against Phytophthora pathogens by blocking the virulence function of RXLR effectors.

疫霉菌在侵染过程中分泌大量的RXLR效应分子进入植物细胞抑制寄主防卫反应。解析RXLR效应分子的毒性机制有助于发现控制疫霉菌病害的新途径。前期研究发现抑制植物程序性细胞死亡（PCD）是大豆疫霉RXLR效应分子的重要毒性功能，但目前对抑制机制的了解还不够深入。实验已证明RXLR效应分子蛋白C端的W-motif是抑制植物PCD功能的主要蛋白域，并预测和验证了其中关键的氨基酸位点。本项目拟对大豆疫霉的RXLR效应分子Avh5展开研究，筛选其W-motif的寄主互作靶标，揭示其毒性功能；通过核磁共振法解析W-motif和靶标蛋白复合体的三维结构，建立蛋白-靶标互作模型；比较分析蛋白互作对结合部位结构变化的影响，深入了解RXLR效应分子抑制植物PCD的机制。通过本研究，期望在了解和认识机制的基础上，为探索基于阻断RXLR效应分子毒性功能的新型疫霉菌病害防控策略提供理论支持。

前期研究发现，一个侵染中上调表达的大豆疫霉RXLR效应子Avh5能够强烈抑制植物程序性细胞死亡，亟待解析其中的分子机理。在基金的资助下，通过酵母双杂交筛库的方法来寻找Avh5在植物中的作用靶标，并通过蛋白三维结构解析来寻找两者互作的主要结构域和关键位点。本项目实施过程中，构建了受侵染初期阶段0-24小时大豆和烟草的cDNA文库，文库重组率100%，总克隆数达1360万，质量较好。通过酵母双杂交筛选，获得了400多个阳性克隆。测序结果显示，“Glycine max E3 ubiquitin-protein ligase complex SLX5-SLX8”的重复率最高，推测可能是Avh5的寄主靶标。进一步通过GST Pulldown和双分子荧光互补实验证实了两者的互作。Avh5的蛋白结构分析显示，其C末端的W-motif形成一个卡钳状结构，推测与蛋白互作有关，并且证实Avh5的C末端突变体和精简的W-motif域都可以与该靶标蛋白互作。通过Avh5与靶标蛋白复合物结构解析证实，Avh5的钳口结构是与靶标互作的主要区域，并预测了互作的关键位点。通过突变W-motif的预测位点发现位于第二个α螺旋上的氨基酸是其抑制植物PCD以及与靶标相互作用的关键位点。突变后的两个突变体M5和M6均不能与靶标蛋白互作，进一步证实Avh5是通过W-motif第二个α螺旋上的关键氨基酸与SLX5-SLX8互作，从而抑制寄主植物的程序性细胞死亡。SLX5-SLX8复合物是一种蛋白SUMO（Small ubiquitin-like modifier）化的E3泛素连接酶。蛋白SUMO化主要调节蛋白质的相互作用和定位等，通过调控调节蛋白的SUMO化过程参与细胞内的多种生理过程，其中SLX5-SLX8复合体在DNA损伤后修复过程中具有重要的作用，而转录组数据也证实表达Avh5之后，与DNA复制相关的基因发生了显著的变化，因此推测病原物可能通过增强DNA损伤的修复能力来逃逸细胞死亡。本研究证实了大豆疫霉致病关键效应子Avh5通过靶定寄主SUMO化E3泛素连接酶SLX5-SLX8来控制植物PCD，对于揭示疫霉菌的致病机理具有重要的研究意义。