辣椒疫霉菌效应蛋白RxLR23晶体结构及转运机制研究

Oomycete pathogens such as Phytophthora capsici cause some of the most destructive plant diseases, and enhance susceptibility by delivering a large number of effectors (RxLR and CRN) into host plants. But the mechanisms of effector translocation are not well understood, and are an area of active research and debate. The role of RxLR motif in RxLR effector entry has been experimentally demonstrated using mutations, and entry is mediated by effectors and phosphoinositides (PIPs) resident in the host plasma membrane such as phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3P). However, recent reports regarding the PIPs binding sites in these proteins, differ on whether the N-terminal RxLR region, C-terminal effector region or both regions are involved. These differences are difficult to resolve without three-dimensional structural data to directly identify key PIPs-interacting residues. In this project, we will solve the crystal structures of RxLR23 from Photophthora capsici and RxLR23-PI3P complex, then use a combination of liposome-binding assays, surface plasmon resonance measurements (SPR), isothermal titration calorimetry (ITC), circular dichroism spectrum (CD), cell entry assays and site-directed mutagenesis to determine the PI3P-binding sites in RxLR23 and elucidate its translocation mechanism based on crystal structural analysis. The result will contribute to the understanding of how oomycete pathogens use effectors to manipulate host cells to establish a parasitic relationship. Furthermore, the detail translocation mechanism may inform durable disease control measures for protecting crops from such pathogens.

植物病原卵菌效应蛋白转运机制已成为植物病理学热点科学问题。研究发现RxLR效应蛋白与寄主质膜外3-磷酸磷脂酰肌醇（PI3P）有效结合，利于效应蛋白入侵植物细胞，但缺乏RxLR全长三维结构及与PI3P复合物结构的确证，RxLR是分别以N-端或C-端结构域还是以N-端和C-端协同结合PI3P，其结合位点及方式存在争议。本申请拟借助分子遗传学、生物化学及结构生物学技术，深入开展RxLR23转运机制研究：1）基于RxLR23的C-端三维结构进一步进行晶体优化，解析全长三维结构；2）优化RxLR23与PI3P的有效结合，解析RxLR23与PI3P复合物三维结构；3）综合比较分析RxLR23及其与PI3P复合物三维结构，明确RxLR23与PI3P结合位点和结合方式，探明RxLR23入侵寄主转运机制。预期有望丰富卵菌与寄主互作的分子遗传理论，为基于效应蛋白转运机制设计新型病害防控策略提供理论依据。

效应蛋白是病原菌侵染寄主的重要武器，其作用机制研究已成为植物病理学的热点科学问题。重要蔬菜致病菌辣椒疫霉菌的基因组编码300多个RxLR效应蛋白，这些效应蛋白如何进入寄主细胞并干扰寄主免疫性有待揭示。本项目选取效应蛋白RxLR23为研究对象，借助结构生物学、生物化学及分子遗传学技术，深入开展了其结构与作用机制研究，取得系列创新性成果：1）通过蛋白质表达纯化、晶体优化、衍射数据收集，解析出RxLR23的三维结构，发现其含有3个保守的WY结构域，为立足结构研究功能提供了充分依据；2）在此基础上，开展了RxLR23作用机制研究：①利用CRISPR/Cas9系统敲除RxLR23，敲除转化子侵染寄主的能力明显减弱，说明RxLR23在辣椒疫霉的侵染过程中发挥重要作用；②农杆菌瞬时表达RxLR23，接种本氏烟叶片和辣椒自交系叶片，分别产生轻微的细胞坏死（效应蛋白触发的免疫反应，Effector-Triggered Immunity，ETI）及明显的细胞坏死，但RxLR23的3个WY结构域对于触发烟草叶片ETI没有明显的不同；③带有RxLR23的农杆菌接种到本氏烟叶片后能够促进辣椒疫霉游动孢子的侵染；④构建了RxLR23与GFP融合蛋白，利用激光共聚焦发现其定位于细胞质和细胞核；⑤利用酵母双杂交（Y2H）、免疫共沉淀（Co-IP）、双分子荧光（BiFC）确认了其寄主靶蛋白为早期响应脱水蛋白（TS）。脱水蛋白多与干旱、寒冷、盐害相关，本研究首次发现卵菌效应蛋白可以通过与寄主脱水蛋白互作调控寄主的生长代谢，进而影响其免疫性。该研究结果为深入开展卵菌效应蛋白与寄主互作分子机理研究提供了数据积累，为基于效应蛋白作用机制设计病害新型防控策略提供重要理论依据。目前已发表文章三篇，授权发明专利一项。后续工作计划再发表文章一篇。