利用质谱表征TNF-α诱导的COP9信号小体作用蛋白网络变化

The COP9 signalosome (CSN) has been reported to participate in various signaling pathways to regulate diverse biological processes, including cell cycle progression, DNA damage repair and tumorgenesis. Recently, CSN complex was linked to the NF-κB signaling pathway due to its interaction with the IKK complex. Nevertheless, how the CSN complex is regulated during the NF-κB activation remains unclear. In our preliminary study, we determined that overexpression of IKKs induced enhanced phosphorylation of the CSN5 subunit, which harbors the catalytic site of CSN-mediated deneddylation reactions. Through mutational analyses, it appeared that phosphorylation at serine 201 and threonine 205 of CSN5 impairs CSN-mediated deneddylation. Meanwhile, we found that TNF-α induced IKK activation could also cause the phosphorylation of CSN5 subunit, and lead to the extensive interaction network change of CSN. Thus, in our future study, we are expecting to verify that IKK could directly phosphorylate CSN5. By employing mass spectrometry based QTAX strategy and QconCAT technology, we will be able to high-throughput monitor the change of CSN interaction work at different time points post TNF-α stimulation, dynamically analyze the effects of TNF-α on subunits composition, post-translational modifications and crucial associating proteins of CSN, which would provide explanation for the mechanism of CSN related diseases or tumors and targets for their therapy.

COP9信号小体（CSN）通过参与不同信号通路影响诸多重要的生物学功能，如细胞周期调控、DNA损伤修复和肿瘤发生等。近年来，CSN因为与IKK复合物的相互作用而被链接到NF-κB信号通路，但是具体的调控机制仍不清楚。我们前期研究发现IKK的过量表达会导致CSN的活性亚基CSN5磷酸化，并通过高精度的质谱分析确定IKK诱导的CSN5的S201和T205磷酸化会损害CSN的deneddylation活性。同时，我们发现TNF-α诱导的IKK活化具有类似效应，并导致广泛的CSN作用蛋白网络的变化。因此，证明IKK可以直接磷酸化CSN5，并阐明这一事件对于CSN活性和作用蛋白网络的影响至关重要。运用基于质谱的QTAX策略和QconCAT技术，监测TNF-α刺激后CSN的亚基组成、翻译后修饰以及重要结合蛋白和蛋白复合物的影响，从而为CSN相关的疾病或肿瘤发生机理提供解释，并为其治疗提供靶点。

COP9 信号小体（CSN）是一种高度保守的多亚基蛋白复合物，被报道与许多重要的生物学功能相关，包括细胞周期调控、 DNA 损伤修复和肿瘤发生等。目前研究的最清楚的CSN功能是其deneddylase活性：CSN可以通过其金属蛋白酶活性从Cullin-RING泛素E3连接酶 (CRLs) 的Cullin上去除共价连接的NEDD8分子，从而调节CRLs的活性，进而控制和影响许多基本的细胞过程。NF–κB信号通路是最近被报道与CSN相关联的信号通路之一。有研究报道IKKs可以和CSN复合物的相互作用，并显示CSN5亚基可以通过IKK介导的磷酸化导致CSN5的多泛素化。但是，IKKs是否可以直接导致CSN5的磷酸化及磷酸化发生后的生物学效应尚不清楚。在本研究中，我们发现IKKs可以特异的和CSN5相互作用，并且在体内和体外均可特异的磷酸化CSN5。在诸多IKKs诱导的磷酸化位点中，S021T205这两个位点所在的肽段具有IKKs已知底物的保守序列。进一步的突变研究表明，S201T205突变成D201D205显著抑制了CSN5的deneddylation活性，这可能会导致受CSN调控的CRLs活性的增加，加快IκB的降解，进而激活NF–κB信号通路。深入的分析发现，TNF-α刺激促进了CSN信号小体和IKKα的结合，CSN信号小体和蛋白酶体19S调节颗粒以及eIF3复合物的相互作用得到加强；同时，CSN和各种Cullin蛋白，CRLs组成蛋白以及其底物分子的结合都得到了增强，甚至还出现了一些TNF-α刺激特异性相关的新的CSN结合蛋白。我们推测，很可能是TNF-α刺激导致了CSN信号小体、蛋白酶体19S调节颗粒和eIF3复合物这三种PCI复合物形成一个超级大分子蛋白复合物，从而为TNF-α/NF-κB信号通路的级联信号传导和执行功能提供一个广大的工作平台。该研究的结果有望为利用亲和纯化和质谱生物学手段，研究目标蛋白的翻译后修饰及其功能以及复杂的超级大分子复合物的结构和功能提供范例。