唐氏综合症颅面畸形的体外疾病模型的建立和发病机制的研究

Down's syndrome (DS), which is characterized by trisomy of .chromosome 21, is the most common chromosomal abnormality that affects live-born infants.DS is associated with a number of deleterious phenotypes, including learning disability, early-onset Alzheimer's disease, childhood leukaemia and craniofacial dysmorphology,which is common to all individuals with DS. Neural crest (NC) contribute to the majority of the bone, cartilage, connective tissue and peripheral nervous tissue in the head. The applicant has successfully derived DS patient specific iPSCs cells by extopic expression of cell reprogramming related transcription factors and established efficient differentiation methods of human pluripotent stem cells to neural crest cells (NC). In this study, DS-hiPSCs will be induced to differentiate to NC and different assays, including RNA-Seq,immunofluorescence, quantitative RT-PCR, and FACS, will be carried out to evaluate their gene expression profile,differentiation capacity, the phenotype, migration and proliferation capacity of DS-NC compared to control groups.We aim to establish the in vitro human model of DS and explore the molecular mechanism underlying Craniofacial anomalies in DS individuls, which may provide potential targets for therapeutic intervention to ameliorate craniofacial and other anomalies in DS.

唐氏综合症（Down's syndrome， DS）即21三体综合征，是小儿最为常见的由常染色体畸变导致的出生缺陷类疾病。患儿的主要临床特征为不同程度的认知障碍、早老痴呆、儿童白血病和颅面畸形等。其中，颅面畸形可见于绝大多数的DS患者。在人体发育过程中，神经嵴来源的细胞形成了颅面部大部分的骨、软骨、结缔组织和外周神经组织。申请者前期利用细胞重编程技术成功建立DS病人特异的诱导多能干细胞系（DS-hiPSCs），并掌握了多能干细胞向神经嵴细胞分化的高效诱导方案。本研究拟诱导DS-hiPSCs向神经嵴细胞分化，应用RNA-Seq、免疫荧光染色、实时定量PCR和流式细胞分选等方法，探讨病人来源的神经嵴细胞其基因表达谱、表型、分化能力、迁移能力和增殖能力与正常对照组相比是否存在差异。通过本研究可以建立DS的体外疾病模型并探讨颅面畸形的发病机制，将有助于发现新的致病基因和治疗靶点。

本研究建立了DS特异的诱导多能干细胞系（DS-hiPSCs），通过诱导DS-hiPSCs向神经嵴细胞分化，探讨病人来源的神经嵴细胞在基因表达谱、表型、增殖能力、分化能力和迁移能力与正常对照组之间的差异，探讨DS颅面畸形的发病机制。目前取得的进展如下：.（1）建立了将胚胎干细胞（ES细胞）和诱导多能干细胞（iPS细胞）诱导为神经嵴干细胞（NCSCs）的高效、稳定的分化体系。多能干细胞来源的 NCSCs 表达神经嵴干细胞的标志基因 Sox10，AP2α，P75，HNK1等，在体外具有增殖、迁移能力，能分化为外周神经元、施旺细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和平滑肌细胞；在动物模型体内能存活、迁移并分化为神经元、血管平滑肌细胞、软脑膜细胞和平滑肌细胞等。.（2）利用上述建立的神经嵴分化体系，将DS-hiPSCs诱导为神经嵴细胞并以正常hiPSCs为对照组，发现①DS-hiPSCs的胚体形成率和神经管形成效率明显低于对照组、胚体凋亡细胞的比例显著高于对照组；目前已利用表达谱测序结果找到若干候选基因，正在分析候选基因对于胚体形成率和神经管形成效率的影响及其机制。②DS-hiPSCs神经嵴诱导效率、DS-NCSCs的特异标记基因的表达、增殖能力和多向分化能力与正常组之间无差异，但DS-NCSCs迁移能力比正常NCSCs明显减弱。通过基因表达谱的检测，发现DS-NCSCs的ACS3、ECTD3、CRS2等3个基因的表达水平明显低于正常细胞；将构建的慢病毒表达载体导入到DS-NCSCs中，发现仅ACS3的过表达可以改善DS-NCSCs的迁移能力。相关结果提示，在21三体的细胞中由于ACS3表达下调导致了DS-NCSCs的迁移障碍，从而引起颅面部的畸形。.（3）发现神经嵴特异转录因子ISL1过表达在体外可以促进hMSCs分化为平滑肌细胞，通过促进hMSCs中MCP3的表达，从而促进内皮细胞体外的迁移、抗凋亡和成管能力和体内的血管形成能力。.（4）建立了人诱导多能干细胞经由神经嵴干细胞（NCSCs）分化为肠道神经元的诱导体系，移植到HSCR病人来源的肠道组织，发现NCSCs可以迁移和分化，并可改善巨结肠病人病变肠道组织的蠕动功能。