人/小鼠睾丸SPAG4L蛋白在精子发生过程中介导胞核与中心体连接的分子机制研究

男性生殖健康是当前国际上的一个研究热点。前期研究中，我们分离了一个位于20q11.21的人类睾丸新基因SPAG4L及其小鼠同源基因Spag4L。该基因主要定位于核膜和内质网,是一个睾丸特异性表达基因，受生长发育调控，主要在精母细胞和圆形精子细胞表达，是精子发生特定阶段的一个标志物。本项目拟研究SPAG4L/Spag4L在各级生精细胞中的精细定位，观察该蛋白是否参与联会复合体的锚定和中心体的迁移；研究SPAG4L/Spag4L与核纤层蛋白和核周腔KASH domain 蛋白之间的相互作用，筛选、鉴定新的相互作用蛋白，阐明该蛋白介导胞核与中心体连接的分子机制；最后，对小鼠Spag4L/Spag4L-2基因进行体外基因沉默和活体基因敲除，阐明该基因在精子发生中的功能。期望通过本研究为揭示精子发生减数分裂阶段的分子机制作出有意义的探索，为男性不育的诊断和治疗以及男性避孕药物的研发提供侯选靶标。

遗传因素是影响男性生殖健康的一个重要方面，在前期研究中，我们克隆了人/小鼠睾丸SPAG4L/Spag4L基因，发现该基因在睾丸中特异性表达，受生长发育调控。在前期研究的基础上，按照项目计划，本研究开展了如下研究：（1）对SPAG4L蛋白定位进行了体外实验研究，结果发现，SPAG4L蛋白定位于核膜和内质网，TM和coiled-coil 区对于SPAG4L在核膜上的定位是必需的，而SUN domain 对SPAG4L在核膜上的定位没有影响；（2）首次克隆和鉴定了人SPAG4L的一个新的剪切体SPAG4Lβ（或SUN5β）,发现SPAG4L能定位到核膜，而SPAG4Lβ因缺失跨膜区不能定位到核膜，并且首次制备了针对特定片段的全长SPAG4L蛋白特异性的抗体，为后续研究提供了有力的工具；（3）建立一种新的快速睾丸细胞涂片的制备方法，对小鼠减数分裂过程中的研究发现，Spag4L蛋白在减数分裂各个阶段均有表达，参与了核迁移和核膜重塑过程；（4）应用免疫荧光双标, Co-IP, pull-down, BiFc 等技术，对Spag4L蛋白参与介导核膜与中心体连接的分子机制进行了研究，结果发现Spag4L与KASH domain 蛋白Nesprin-2蛋白相互作用形成复合物。Nesprin-2也与中心体相互作用，因此作为中介通过与核膜蛋白Spag4L相互作用形成复合物将核膜与中心体连接了起来；（5）制备了Spag4L基因敲除模型，结果发现，Spag4L基因敲除小鼠能够正常存活，但是雄性不育！该结果还有待于扩大样本进行验证。通过本研究，我们对SPAG4L蛋白的生理功能有了新的认识，对了解男性不育的分子机制具有重要的意义。