外源性一氧化碳对脓毒症肠屏障功能障碍的影响及分子机制的研究

国内外已有的研究及本研究小组的前期研究结果发现外源性一氧化碳释放分子（CORM-2）抑制脓毒症炎症介质异常表达与释放，减轻炎症诱导器官损伤。但CORM-2对脓毒症时肠屏障的影响及可能机制，尚不清楚。本研究用透射电镜、激光共聚焦显微镜观察脓毒症时肠上皮细胞和细胞间紧密连接形态学改变，肠上皮细胞间紧密连接蛋白Occludin、Claudin、ZO-1的异常分布与表达。以RT-PCR、免疫沉淀及Western blot技术从基因、蛋白水平检测脓毒症时RhoA-Rock信号通路激酶的异常活化，及对下游底物肌球蛋白轻链磷酸化的影响。并用ELISA方法检测脓毒症不同时间点炎症介质的表达和释放变化。同时使用外源性一氧化碳释放分子进行干预，从分子、细胞和动物水平探讨RhoA-Rock信号传导通路及下游相关分子影响肠屏障功能的可能机制，为寻找针对脓毒症肠屏障功能障碍更科学合理的靶向干预点提供新思路。

本研究在离体LPS诱导细胞损伤和CLP脓毒症动物模型上，揭示了外源性一氧化碳释放分子(CORM-2)基于对RhoA-Rock信号通路活化的抑制，从而抑制脓毒症时炎症细胞因子的产生和释放，保护肠屏障紧密连接的完整性。研究结果表明:（1）CORM-2明显抑制LPS 刺激的IEC-6和Caco-2细胞单层炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1的产生与释放，减轻LPS 刺激IEC-6细胞单层损伤后紧密连接蛋白Occludin、Claudin、ZO-1的表达量下降与异常分布，抑制IEC-6和Caco-2细胞肌球蛋白轻链磷酸化水平，降低受损IEC-6单层细胞对葡聚糖的通透性。（2）CORM-2明显抑制脓毒症大鼠炎症因子TNF-α、IL-1β的分泌与释放，维持肠粘膜上皮细胞紧密连接蛋白Occludin、Claudin、ZO-1的表达量与分布，降低脓毒症大鼠肠粘膜上皮细胞肌球蛋白轻链磷酸化水平，减轻脓毒症大鼠肠粘膜屏障的通透性。(3)CORM-2明显抑制LPS 刺激的Caco-2细胞RhoA-Rock信号通路重要调节激酶Rho相关激酶（ROCK-1、ROCK-2）的活化，使下游肌球蛋白轻链激酶（MLCK）活性抑制，肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)活性增加，明显降低肌球蛋白轻链的磷酸化水平，抑制Caco-2细胞单层通透性增加。（4）CORM-2明显抑制脓毒症时RhoA-Rock信号通路调节激酶ROCK-1、ROCK-2的活化，使下游肌球蛋白轻链激酶（MLCK）活性抑制，肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)活性增加，降低肌球蛋白轻链的磷酸化水平，抑制肠粘膜屏障的通透性增加。