NT3通过Ras/MEK/ERK信号通路调控大鼠耳蜗螺旋神经节发育的作用机制研究

Damage and developmental abnormalities in the spiral ganglion will result in deafness. Neurotrophic factor plays an important role in the development of spiral ganglion. In our previous study, we found that neurotrophin-3 could promote survival and neurite growth of spiral ganglion neurons. NT3 combined with TrkC has biological effects on the spiral ganglion, but the intracellular signaling pathway is not clear. NT-3 regulates the development of cerebral cortex through MEK/ERK signaling pathway,but the role of MEK/ERK signaling pathway in the development of spiral ganglion is not clear. The purpose of this study is to investigate the expression level of TrkC and downstream signaling factor Ras, MEK, ERK protein and mRNA in rat spiral ganglion tissues in vitro. The influence of cell transmission was observed by siRNA interference technique silencing TrkC gene, and the influence of Ras, MEK and ERK genes on the development of spiral ganglion cells was observed in vivo. To identify the signaling pathway, TrkC、Ras、MEK、ERK were silenced by siRNA, and the survival cells and neurite growth were evaluated. This study in older to certify the mechanism of NT3 through Ras/MEK/ERK signaling pathway to regulate the development of spiral ganglion in rats, and to provide new targets for prevention and early treatment of deafness.

耳蜗螺旋神经节的损伤与发育异常将会导致耳聋。神经营养因子在耳蜗螺旋神经节的发育中起重要的作用。我们的前期工作中发现NT3促进螺旋神经节细胞的存活以及神经突起的分化和生长的作用。NT3与其受体TrkC结合后发生生物学效应，但其细胞传递机制尚不明确。研究表明NT3通过MEK/ERK信号通路调控大脑皮层的发育，但MEK/ERK信号通路在耳蜗螺旋神经节发育中的作用方面尚不清楚。本项目拟通过体内实验，检测大鼠耳蜗螺旋神经节组织中TrkC以及下游信号传递因子Ras、MEK、ERK蛋白与mRNA的表达水平；在体内实验中，通过siRNA干扰技术沉默TrkC基因后观察细胞传递的影响，并沉默Ras、MEK、ERK基因后观察其对螺旋神经节细胞发育的影响，从而探讨NT3通过Ras/MEK/ERK信号通路调控大鼠耳蜗螺旋神经节发育的作用机制，为耳聋的预防与早期治疗提供新的靶点。

神经营养因子3（NT-3）通过促进螺旋神经节神经元（SGN）的存活、分化和迁移，促进耳蜗的发育，提高耳蜗对外界刺激的反应能力。然而，NT-3及其特异性受体原肌球蛋白受体激酶C（TrkC;也称为ntrk3）在SGN中的时空表达尚不清楚。我们目前的工作旨在使用免疫荧光和蛋白质印迹技术分析NT-3和TrkC在出生后第0天（P0），P5，P10，P15，P20和4周（4W）的六个产后发育期的表达模式，并讨论它们与SGNs发育的相关性。我们采用双重免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜来检测Tuj1（β-III微管蛋白，神经元标志物）标记的SGN中NT-3或TrkC的亚细胞定位。在本研究中，观察到NT-3主要在SGNs和神经胶质细胞的细胞质中表达;TrkC主要在SGN的细胞质和细胞核中表达，少数在神经纤维内表达。该表达式沿耳蜗纵轴呈梯度改变。P0 开始，NT-3 表达在耳蜗底部，随着 SGN 的成熟向顶转发展，而 TrkC 在耳蜗底部保持恒定的表达水平。采用western blot检测SGNs中NT-3、TrkC、RAS、MEK和ERK的表达，结果表明，NT-3的蛋白水平从P0到P5非常低，但在P10到4W时显著升高。然而，TrkC的蛋白表达水平在出生后阶段逐渐下降，在4W时达到最低水平。RAS在P0,P5,P10时期逐渐下降，但在P15,P20时期表达上升；MEK随发育进展呈现逐渐下降的趋势；ERK在P0,P5,P10时期逐渐下降，但在P15时期显著升高，随后在P20和4W时呈下降趋势(P<0.05)。因此，我们的数据提供了证据，证明NT-3可能通过直接或间接激活体内的受体TrkC，激活RAS/MEK/ERK信号通路来促进SGN的存活。