基于水通道蛋白8调控活化肝星状细胞线粒体凋亡途径探讨马兰贴敷脐疗法治疗肝硬化腹水的作用及机制研究

Hepatocirrhosis ascites is a common complication of many hepatic diseases terminal stage（Decompensated period）which has a great impact on human health.Portal hypertension is generally approved as the main lead to hepatocirrhosis ascites.Induced activation of HSC apoptosis is an important target to control portal hypertension has formed and to treat hepatocirrhosis ascites.Mitochondrial mediated cell apoptosis pathway is one of the main signaling pathways of HSC apoptosis. Aquaporin（AQP）probably participate in the regulation of mitochondrial apoptosis pathways. We use the Miao nationality herbal medicines of maran to treat the disease and develop into moxibustion dosage forms and skin sticking plaster applied the umbilicus, which has definite effect and has certain characteristics and advantages, but its specific function chennel and mechanism is uncertain.Consequently, we found malan sticking umbilical therapy as a stimulus patterns to intervene model in rats of hepatocirrhosis ascites, In addition，malan ethanol extract is applied to intervene on rat hepatic stellate cells (HSC) cultured in vitro.observe its effect from vitro to vivo.Inaddition ,we applying a variety of means of biotechnology such as laser resonance focusing microscopy, immunohistochemistry, western blot，etc. To observe a range of variations which AQP8 expression changes, the apoptotic of activated hepatic stellate cell, the change of mitochondrial function and structure, we attempt to makes a preliminary exploration function effect and mechanism in malan sticking umbilical therapy hepatocirrhosis ascites from one point of view of AQP8 expression changes - activated mitochondrial hepatic stellate cell apoptosis pathway.

肝硬化腹水是许多肝脏疾病终末期（失代偿期）的常见并发症，对人体健康影响极大。我们运用苗药-马兰制作为灸剂、外用贴剂通过敷脐治疗本病,效果良好,具有一定特色和优势，但其具体作用及机制尚不明确。门脉高压，是目前较为公认的导致肝硬化腹水的主要原因。HSC的活化在门脉高压形成中起着关键作用。诱导活化HSC凋亡是控制门脉高压形成，治疗肝硬化腹水的重要靶标。线粒体介导的凋亡通路是HSC凋亡的主要信号通路之一。AQP8可能参与线粒体凋亡通路的调控。因此，拟用马兰贴敷脐疗法为刺激手段干预肝硬化腹水模型大鼠，并用马兰乙醇提取物干预体外培养并激活的肝星状细胞，从体内、外观察其作用，并运用激光共振聚焦显微镜术，免疫组化、WB等多种生物技术手段，观察AQP8表达变化、活化肝星状细胞凋亡情况、线粒体功能改变等，试从AQP8表达变化-调控活化肝星状细胞线粒体凋亡通路角度初步探究马兰贴敷脐治疗肝硬化腹水的作用及机制。

肝硬化腹水是许多肝脏疾病终末期(失代偿期)的常见并发症，其3年生存率尚不足50%，严重影响到患者的生活质量。中医则认为本病由脾土受伤，不能运化，清浊相混，隧道壅塞，湿热相生而成。贵州道地苗药材——马兰草有清热解毒, 散瘀止血, 温肺止咳, 散寒止痛, 消积之功效，马兰草中所含有的大黄酸、大黄素等蒽醌类化学成分具有良好的保肝、护肝、抗肝纤维化的作用，临床常用于传染性肝炎、水肿、黄疸等疾病的防治，效果显著。.HSC的活化在门脉高压形成中起着关键作用。诱导活化的HSC凋亡是控制门脉高压形成、治疗肝硬化腹水的重要靶标。线粒体介导的凋亡通路是HSC凋亡的主要信号通路之一。AQP8可能参与线粒体凋亡通路的调控。课题组前期对马兰草生物活性、微量元素、质量标准进行了研究， 初步发现苗药马兰对 H22肝癌细胞AQP8、9、细胞凋亡有一定影响，马兰草脐灸对肝硬化腹水大鼠肝组织AQP8、9及线粒体均有影响。另外，课题组制备了马兰草凝胶外用贴剂并开展透皮吸收实验，疗效显著，初步发现马兰脐灸及凝胶膏敷脐均对肝硬化腹水大鼠肝功能、线粒体功能以及活化的HSC凋亡有一定影响。鉴于此，本项目以AQP8→线粒体凋亡通路激活→活化的HSC凋亡假说立论开展体内外实验，分别以肝硬化腹水模型大鼠和活化的HSC为研究对象，马兰草凝胶脐贴和马兰草乙醇提取物为干预手段，利用HE染色(在体)、Masson染色(在体)、TUNEL-α-SMA 双标记(均有)、免疫荧光(在体)、ICC(离体)、PCR(均有)、WB(均有)和流式细胞术(均有)等生物学检测方法，从线粒体细胞凋亡途径相关蛋白表达及AQP8表达变化方面，分别探究马兰草凝胶脐贴抗肝硬化腹水以及马兰草乙醇提取物促活化的HSC凋亡的作用机制。.本研究中在体实验结果表明马兰草凝胶脐贴可通过提高肝硬化腹水大鼠AQP8表达，降低∆Ψm，促进凋亡因子Cyt-C释放，诱导活化的HSC凋亡，从而改善肝硬化腹水大鼠症状，消退腹水，提高ALB、COP水平，保护肝功能；同时离体实验结果也表明，马兰草乙醇提取物可通过提高体外活化HSC-T6 的增殖抑制率，高表达AQP8，降低∆Ψm，促进Cyt-C 释放诱导细胞凋亡。课题研究为民族医药、中医外治法的开发利用及在治疗本病中的应用提供更多的科学和实验依据。