诺加霉素生物合成途径中的糖基化后修饰机制及相关组合生物合成研究

诺加霉素是结构最复杂的蒽环类抗肿瘤抗生素之一，我们从已报道的诺加霉素部分生物合成基因出发，克隆其生物合成基因簇中的三个糖基转移酶基因，并首次通过基因敲除与回补实验，研究这三个参与其蒽环骨架糖基化的糖基转移酶的功能，确定它们的底物与合成途径，阐明其生物合成途径中糖基与蒽环骨架两次缩合成并环的后修饰机制，并通过敲除和重组相关基因获得组合生物合成产物；在此基础上，我们构建无糖基配体的柔红霉素蒽环骨架（包括D环1位羟基化的骨架）产生菌，并改造相关基因形成多样化的糖基配体，将诺加霉素糖基转移酶与后修饰酶基因导入这些菌株中表达，以期得到在柔红霉素蒽环骨架不同位点缩合不同糖基化配体的组合生物合成产物。本项研究将阐明诺加霉素的生物合成途径中复杂的糖基化与后修饰机制，这将增加对该类抗生素实施组合生物合成的手段，并且希望从相关组合生物合成产物中筛选到更易与糖醛酸结合的高效低毒的新型蒽环类抗生素。

蒽环类抗生素是最重要的抗肿瘤抗生素家族，具有抗瘤谱广、临床疗效高、对乏氧细胞有效的显著特点，主要用于乳腺癌、恶性淋巴瘤、胃癌、肺癌等实体瘤的治疗，已成为广谱抗肿瘤抗生素的代表，其临床使用量一直居于抗肿瘤抗生素首位。诺加霉素是结构最复杂的蒽环类抗肿瘤抗生素之一，目前该抗生素生物合成途径中糖基化后修饰的机制仍不清楚。诺加霉素生物合成基因簇中包括三个具有糖基转移酶同源性的酶基因，我们首先建立和优化了诺加霉素的发酵产生和检测方法。从已报道的诺加霉素部分生物合成基因出发，我们克隆其生物合成基因簇中的三个糖基转移酶基因，并首次通过基因敲除实验，分别构建了三个糖基转移酶的突变株DYG4001、DYG4002和DYG4003。snogD的同框敲除和snogE的基因敲除突变株完全阻断了诺加霉素的产生，表明snogD and snogE是诺加霉素糖基化后修饰的必需基因。而snogZ的同框敲除只将诺加霉素的产量减少到原有野生型的28%。研究表明snogZ不是诺加霉素糖基化后修饰的必需基因，而是其他糖基转移酶的激活基因，这是蒽环类抗生素中被发现的第二例该类基因。我们的工作还包括中断一系列诺加糖与诺加糖氨生物合成途径中的糖基合成酶基因，例如：SnogK (葡萄糖脱氢酶基因)、SnogA(氨基甲基化酶基因)和SnogC(脱氢鼠李糖还原酶基因)等。另外，我们还使用柔红糖胺氨基转移酶基因dnrJ（与snogI功能一致，酶作用立体选择性相反）替换负责催化诺加糖胺形成的氨基转移酶基因snogI，构建可能产生表异构诺加糖胺结构诺加霉素的突变株。我们发酵了一系列诺加霉素产生菌突变株mLMX-3-59-A， mLMX-3-59-C ，mLMX-3-59-K 和mLMX-3-100，在突变株的发酵液中得到了新的次级代谢产物SIPI-015，更多的新型次级代谢产物的发现正在进行中。本项研究阐明诺加霉素的生物合成途径中复杂的糖基化与后修饰机制，增加了对该类抗生素实施组合生物合成的手段，并且有望从相关组合生物合成产物中筛选到更易与糖醛酸结合的高效低毒的新型蒽环类抗生素。