通过ubi1内含子改造提高单子叶植物外源基因表达

转基因作物面临的两个基本问题是如何提高外源基因的表达水平和如何提高转基因作物的生物安全性。内含子是真核生物基因特有的调控方式，利用内含子增强效应即可以提高基因的表达水平，又可以利用内含子的存在防止外源基因转移到土壤微生物或者肠道微生物中表达，提高转基因作物的生物安全性。在前期研究中发现当将玉米ubiqutin第一内含子置于GUS基因的+13位时可以有效地提高玉米外源基因的表达，在本项研究中通过对ubi内含子序列改造和插入位点分析，建立一个可在不同基因编码区插入内含子并适用于多种单子叶植物转化的载体模型，为提高单子叶植物外源基因表达提供新型调控元件；利用该载体模型改造苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）杀虫基因cry1Ah，通过玉米稳定表达体系获得抗虫性良好的转基因玉米，验证载体模型，为构建高效、安全的转基因作物提供参考。

本项目通过对来源于玉米的ubiquitin内含子进行改造,旨在获得增强能力提高、并可以在单子叶植物中普遍应用的内含子，为单子叶植物基因转化提供增强基因表达的元件。本项目在三年的实施过程中，按照研究内容完成了各项研究任务，取得了预期成果，发表研究论文7篇，申请国家发明专利2项，培养1名博士研究生和2名硕士研究生。.研究者通过生物信息学分析发现在内含子中存在着一些剪接调控基序，这些基序在内含子介导的增强效应中发挥重要作用。我们在前期研究中发现玉米ubiquitin基因的第1个内含子（ubi1）可以有效提高外源基因的表达水平，可以提高报告基因表达5倍以上。在本研究中通过对ubi内含子缺失分析，获得了八个内含子缺失片段，并构建了pSG(13i-P1)N、pSG(13i-P2)N、pSG(13i-P3)N、pSG(13i-P4)N、pSG(13i-P5)N、pSG(13i-P6)N 、pSG(13i-A)N和pSG(13i-B)N八个表达载体，通过基因枪转化玉米愈伤组织，通过对报告基因gus的表达分析发现：ubi1的3’末端位置缺失比5’末端缺失更能影响内含子的增强效应，并且发现P5内含子片段较全长ubi1更能提高外源基因的表达。为了进一步获得提高表达水平更高的内含子片段，对P5内含子进行相应的点突变，获得了pSG(13i-M1)N（或pSG(13i-M78)N）、pSG(13i-M2)N、pSG(13i-M3)N、pSG(13i-M5)N pSG(13i-M11)N、pSG(13i-M282)N和pSG(13i-M510)N七个内含子突变表达载体，通过基因枪转化玉米愈伤组织，通过分析gus基因表达水平，发现ubi1中的突变位点与内含子增强效应直接相关，不同位点的突变在基因表达中的效果不同，其中pSG(13i-M5)N载体增强效应更加明显，由此获得了改造的P5和M5新型内含子，它们的增强效应均高于ubi1。.建立了在单子叶植物转化中通用的含有内含子的载体模型-pSAinGN和pSA12inGN，获得了pSAiGN（含全长ubi1）、pSAP5GN、pSAM5GN、pSA12iGN、pSA12P5GN和pSA12M5GN六个通用表达载体，基因枪转化法分别转化玉米和水稻的愈伤组织，六个通用载体在玉米和水稻的愈伤组织中均体现出了增强效应，并且在这两种材料中表达特征非常相似。