臭灵丹抗呼吸道病毒的实验研究

Acute respiratory infectious diseases (ARID) have been a main issue of public health. Adults are susceptible to influenza virus infection while infants and old people are vulnerable groups to respiratory syncytial virus (RSV). Therapies for ARID are not sufficient, as viruses have evolved resistance to the two major influenza antiviral agents in current use, namely, the neuraminidase inhibitors and the M2 ion channel inhibitors. It has been found in our studies during the 2009 H1N1 flu pandemic that Chinese herb medicines with Laggera pterodonta (DC.) Benth as the major constituent showed satisfactory anti-flu effect in clinical application. The ethanol extract of Laggera pterodonta specifically inhibited the enveloped viruses, such as influenza virus and RSV in the in vitro screening experiment. Further investigations on virus neutralization and early replication revealed the active parts of Laggera pterodonta (DC.) Benth. However, the compounds responsible for the antiviral activity of Laggera pterodonta, the targets of these active compound as well as their antiviral spectrum are yet to be elucidated. Thus this research aim to determine the active chemical constituents of Laggera pterodonta, to establish the HPLC fingerprint of the active composition and to inspect the drug targets of Laggera pterodonta in virus replication inhibition. This research will provide evidence for the rational use of Laggera pterodonta and contribute to the development of Yunnan pharmaceutical industry.

急性呼吸道感染病长期危害着大众健康，主要表现为一般人群易感流感病毒、婴幼儿及老年人易感呼吸道合胞病毒（RSV），治疗药物有限。抗流感主要药物神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道抑制剂都已产生耐药，RSV目前尚无有效治疗药物。课题组在2009年我国甲型H1N1流感流行期间临床工作中，发现以臭灵丹为主要药材的药品有很好的临床抗病毒效果。对臭灵丹醇提物进行抗病毒活性筛选，结果显示能够特异性的抑制呼吸道包膜病毒。基于此而开展的前期基础研究，结合病毒中和杀伤和增殖抑制作用，初步确认了抗病毒作用及有效部位。但是臭灵丹抗病毒活性成分、作用靶点及抗呼吸道病毒谱尚不明确。本项目拟在化学成分研究基础上系统追踪臭灵丹的活性成分、制定HPLC指纹图谱、抗病毒谱，并探讨其抑制于流感病毒复制的靶点，为臭灵丹的资源利用和推动云药产业发展奠定基础。

急性呼吸道感染病长期危害着大众健康，课题组在2009 年我国甲型H1N1 流感流行期间临床工作中，发现以臭灵丹为主要药材的药品有很好的临床抗病毒效果。在该项目资助下，（1）对含有臭灵丹的中药复方制剂进行组方分析，对其中的主要成分臭灵丹和蒲公英总提取物进行了抗流感病毒作用研究，明确臭灵丹为主要活性中药材，并进一步明确臭灵丹中倍半萜类成分和黄酮类成分为主要活性组分。（2）在化学成分研究中，共计分离得到26个单体化合物，对倍半萜化合物进行了抗流感活性筛选，发现其中3个倍半萜类成分活性显著，特别对臭灵丹酸单体化合物进行了抗病毒谱和作用机制研究。结果表明:臭灵丹酸通过抑制NF-κB活化和病毒核糖核蛋白的释放来发挥抗流感病毒的作用，另外也降低了H1N1甲型流感病毒诱导的IL-6，IP-10，MIP-1β和MCP-1的表达水平，及H9N2甲型流感病毒感染诱导的CCL-5，IP-10，TNF-α和MIP-1β的表达水平。这意味着臭灵丹酸的抗病毒活性与抑制促炎细胞因子和趋化因子的表达有关。（3）在资源考察过程中，采用HPLC色谱仪以臭灵丹酸、冬青酸、洋艾素为标志物，对不同产地和不同采收时间采收臭灵丹药材进行了含量分析，明确云南省境内臭灵丹药材以德宏州产绿色杆茎植株为佳，以11月份采收为宜，并建立了臭灵丹HPLC指纹图谱。（4）优化超临界萃取工艺，富集得到富含倍半萜类成分的活性组分：其中以冬青酸和臭灵丹酸为代表的单体化合物达50%以上的倍半萜类组分。（5）修订臭灵丹药材质量标准（草案）。. 通过该项目实施，从臭灵丹中分离得到26个单体化合物，阐明了中药材臭灵丹抗呼吸道病毒的物质基础及其主要成分臭灵丹酸的作用机制，明确了药材的最佳采收季节和地区，并制定了HPLC指纹图谱。这些工作为臭灵丹临床用于抗呼吸道病毒提供了科学依据。