烟曲霉Rho1蛋白对其细胞壁生物学特性、致病力及诱发宿主天然免疫应答的调控机制研究

Aspergillus fumigatus is a major pathogen of invasive pulmonary aspergillosis. Rho1 is a regulatory subunit of β-1,3-D-glucan synthase. It regulates the synthesis of β-1,3-D-glucan, which is one of the major components of the cell wall and pattern recognition molecule of A.fumigatus. Rho1 plays an important regulatory role in A.fumigatus growth, cell wall integrity and morphology generation in fungi. However the rho1 gene fully knockout strains was never successfully constructed, which hindered the further study on downstream regulatory networks of Rho1 protein. The regulation mechanism of Rho1 protein on A.fumigatus cell wall, the biological characteristics, pathogenesis and host immune response are still unclear. We successfully disrupted A.fumigatus rho1 gene completely at 25 ℃. One the basis of this, we intend to study the effects of rho1 gene on A.fumigatus cell wall structure, drug sensitivity, and to explore differences in gene expression of A.fumigatus before and after deletion of rho1 gene. Further we will assess the impact of rho1 gene deletion on the virulence of A.fumigatus in vitro and in vivo. This study will help to fully reveal the function of Rho1 protein in A.fumigatus infection and host innate immune response, and provide a scientific basis for the development of possible drug target.

烟曲霉是侵袭性肺曲霉病的主要病原菌。Rho1是β-1,3-葡聚糖合成酶的调节亚基，调控细胞壁主要成分及免疫模式识别分子β-1,3-葡聚糖的合成，在真菌的生长发育、细胞壁完整性和形态生成等方面发挥重要作用。但是由于无法获得烟曲霉rho1基因完全敲除株， 对其Rho1蛋白的下游信号调控网络难以深入解析，有关其细胞壁生物学特性、致病力及诱发宿主天然免疫应答的具体分子调控机制均不清楚。我们前期在25℃条件下成功筛选到烟曲霉rho1基因完全敲除株，本项目拟在此基础上研究rho1基因缺失对烟曲霉细胞壁表面特征、主要结构成分及药物敏感性的影响规律；探讨rho1基因缺失前后烟曲霉基因的差异性表达情况；然后从细胞水平和动物水平上解析该基因对烟曲霉致病力和诱导宿主天然免疫应答的调节机制。项目的完成将有助于全面揭示Rho1蛋白在烟曲霉感染及宿主天然免疫应答中的功能，为寻找可能的药物研发靶点提供重要科学依据。

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是引起侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)的主要病原真菌，其感染可严重破坏肺组织，病情进展迅速，目前缺乏有效的治疗策略，病死率高（可高达90%）。Rho1（Ras homologue 1）是β-1,3-葡聚糖合成酶的调节亚基，属小G蛋白家族中Ras亚家族的一员，通常作为信号转导通路中的信号转换器或分子开关。对酿酒酵母、构巢曲霉等非临床致病真菌的研究发现，Rho1蛋白缺失可影响细胞壁完整性（Cell Wall Integrity，CWI），造成形态学发生明显改变。但是，对于临床重要致病真菌——烟曲霉，人们始终未获得其rho1基因完全敲除株，这严重制约了对Rho1蛋白在烟曲霉生长发育、致病力及与宿主免疫相关作用的研究。另外，由于β-1,3-葡聚糖是烟曲霉细胞壁上重要的免疫模式识别分子，Rho1作为其合成酶调节亚基，其缺失对烟曲霉感染及宿主天然免疫应答的影响尚不清楚。.主要研究内容包括：.1 研究rho1基因敲除后烟曲霉细胞壁生物学特性的变化情况。.2 解析rho1基因是如何调节β-1,3-葡聚糖的合成，有哪些关键的位点以及其下游的调控网络。.3 从细胞水平和动物水平上研究rho1基因表达变化后对烟曲霉致病力的影响。.工作中，我们成功构建并筛选到烟曲霉rho1基因条件性敲除株（△rho1teton）并构建了过表达株。初步实验证实：△rho1 teton在37℃条件下生长缓慢，对高温敏感性增强。这种rho1基因缺失导致温度耐受性改变的情况在以往烟曲霉研究中尚未见报道，与构巢曲霉等真菌的研究结果也不相同，另外我们还发现，rho1低表达时对细胞壁干扰剂荧光白和刚果红的敏感性，对氧化压力耐受性明显的高于野生株，并出现胞质泄露现象。进一步研究发现，rho1低表达时细胞壁表面多糖合成减少，引起由CWI通路介导的细胞壁完整性缺陷。Rho1的缺失导致了烟曲霉在大蜡螟动物模型中的致病力下降，炎症因子释放以及死亡率的降低。.本研究揭示了rho1基因在烟曲霉细胞壁合成、生长发育及宿主天然免疫应答等方面的重要作用，为有效治疗侵袭性曲霉病及控制烟曲霉感染提供新的理论基础和潜在的药物靶点。