呼吸道合胞病毒（RSV）NS1蛋白利用自噬机制抑制细胞Ⅰ型干扰素应答的作用研究

Respiratory syncytial virus (RSV) NS1 protein can attenuate antiviral innate immune response to mediate immune evasion, however, the mechanism still remains largely elusive. Our preliminary work showed that NS1 protein could induce autophagy. But we still don’t know the role of NS1-induced autophagy in innate immune regulation during RSV infection. We found that NS1 lost its ability to inhibit typeⅠinterferon response in autophagy defective cells. So we speculate that NS1 may inhibit cellular interferon response through activating autophagy pathway. To further explore its possible molecular mechanisms, we concentrate on a mitochondrial protein—mitochondrial Tu translation elongation factor (TUFM). TUFM is an important mitochondrial protein that can modulate either autophagy or interferon response. Further research showed that NS1 co-localized with TUFM. And NS1 lost its ability to increase autophagy marker protein expression (LC3Ⅱ)and inhibit interferon gene expression in the cells transfected with siTUFM. The hypothesis is proposed that NS1 may induce autophagy through interactions with TUFM, and then inhibits cellular interferon response. Taking TUFM as the cut-in spot of this research, we aim to explore the interaction between NS1 and TUFM and the role of their interactions in the NS1 mediated autophagy induction and interferon antagonism. This study contributes to exploring new mechanisms of RSV immune escape and providing new antiviral options targeting TUFM.

呼吸道合胞病毒（RSV） NS1蛋白是介导RSV逃逸宿主天然免疫的主要蛋白，但机制未明。前期研究表明，NS1可诱导细胞自噬，但其诱导的自噬在天然免疫调节中的作用及机制尚不明确。我们发现在自噬缺陷细胞中，NS1拮抗Ⅰ型干扰素产生的能力明显减弱，故推测NS1可能通过激活自噬通路抑制干扰素应答，介导免疫逃逸。为进一步探讨其可能的分子机制，我们关注了一种对自噬和干扰素应答均有调控作用的线粒体蛋白-线粒体翻译延伸因子Tu（TUFM）。进一步研究发现：NS1与TUFM共定位；沉默TUFM后，NS1不能诱导自噬标志蛋白高表达，不能抑制干扰素基因表达。故推测，NS1可能通过与TUFM相互作用诱导自噬，进而拮抗细胞干扰素反应。本研究拟以TUFM为切入点，采用免疫共沉淀和干扰技术等探讨NS1与TUFM相互作用及其在细胞自噬和干扰素拮抗中的作用，为阐明RSV逃逸机制，建立靶向TUFM的抗RSV治疗策略提供思路。

IFN是机体抗病毒感染的第一道防线，线粒体对其调控至关重要。病毒可挟持宿主线粒体逃逸宿主IFN应答。RSV NS1蛋白是一种可定位于线粒体的病毒蛋白，也是抑制IFN应答的主要病毒蛋白。NS1在线粒体的定位能否干扰线粒体稳态，诱导线粒体自噬，进而抑制宿主IFN应答呢？本研究在明确NS1诱导线粒体自噬及抑制宿主IFNβ应答的基础上，通过应用自噬抑制剂初步探讨了自噬在NS1抑制宿主IFN产生中的重要作用。分子机制上，通过质谱技术聚焦与NS1发生相互作用的线粒体蛋白TUFM，并从NS1与TUFM互作角度探讨NS1诱导自噬，进而抑制宿主IFNβ应答的可能分子靶点及机制。最后，应用两种鼠感染模型，分别评价TUFM在RSV诱导自噬及IFN应答中的作用以及自噬在NS1抑制IFNβ中的作用。结果发现：NS1诱导线粒体分裂增多，线粒体自噬发生，并显著抑制宿主IFNβ产生。应用BafA抑制自噬后，NS1抑制宿主IFNβ产生的能力明显减弱，提示NS1依赖自噬机制抑制IFNβ应答。机制上，NS1与线粒体TUFM蛋白发生相互作用，敲降TUFM表达后，RSV NS1向线粒体定位明显减少、诱导自噬及抑制宿主IFNβ产生的能力显著减弱，提示NS1依赖TUFM分子诱导自噬并抑制宿主IFN，它在线粒体的定位可能至关重要。通过构建截短突变体和COIP试验，初步明确TUFM结构域2（275-344aa）可能在其与NS1的相互作用中更重要。此外，NS1可与自噬体LC3Ⅱ蛋白发生相互作用，提示，NS1蛋白有可能作为一种接头蛋白，将自噬体靶向线粒体诱导线粒体自噬发生。应用腺相关病毒（AAV）定向敲降鼠肺TUFM蛋白表达后，鼠肺组织LC3Ⅱ蛋白表达水平降低，IFNβ表达升高，病毒复制水平降低，鼠肺组织病理损伤明显改善，亦提示TUFM在病毒诱导自噬、抑制Ⅰ型IFN应答、加重病毒病理损伤中发挥重要作用。此外，在C57BL/6 ATG5 flox/flox+cre鼠中，RSV NS1蛋白对IFNβ表达的抑制作用消失，对病毒复制及肺组织病理损伤的促进作用显著减弱。提示：RSV NS1蛋白依赖自噬机制抑制IFNβ表达，促进病毒发生免疫逃逸，促进RSV复制及肺组织病理损伤。本研究将为理解RSV免疫逃逸机制提供新视角，为建立靶向TUFM蛋白的抗病毒药物提供新靶点。