移植抗体CDR2F9及其抗脓毒症的作用机制研究

We established the Hela-CD14 cell line and expressed high active chimeric antibody against human CD14 under the support of the previous China National Funds for Young Scientists. But the chimeric would induced many side-effects, such as HACA and HAMA et. al. due to its 30% mouse derived protein. Compared to chimeric antibody, the CDR grafted antibody helds less immunogenicity and keeps well reactinogenicity due to the removal fo 90% mouse derived protein and remain of the CDRs. CD14 plays initial and pivotal function during the inflammatary storm followed by LPS besides served as the symbolic and differentiation mark in monocytes. P2A is a self-processing 13 peptides derived from foot and mouth disease virus. ubiquitous chromatin opening element (UCOE) is more efficient than CMV and SV40 promotors. Herein, we wouldl carry out the study on the CDR grafted antibody of 2F9 and its mechanism against sepsis.

在上个青年基金资助下，我们获得了稳定的Hela-CD14细胞株及高活性的抗人CD14嵌合抗体Ch2F9。但是，Ch2F9只是部分人源化抗体，保留了30%鼠源性，临床上反复应用，会产生较多的副作用，如HACA和HAMA等。与嵌合抗体比较，CDR移植抗体不仅最大程度的保留了抗体的反应源性，更是去除了90%以上的鼠源性蛋白，从而使抗体的免疫源性进一步降低。CD14不仅是诊断急性单核细胞白血病（M5）的重要标志，更是革兰阴性菌感染和LPS刺激所致的炎症风暴起始和关键分子。P2A蛋白肽是来自手足口病病毒的、能自我降解的13肽，UCOE启动子是较CMV和SV40启动子更高效的真核启动子。我们拟通过一系列的基因克隆方法，以P2A为连接肽，UCOE为启动子表达2F9的CDR移植抗体（CDR2F9），并通过体外体内实验研究CDR2F9抗脓毒症和全身炎反应综合征（SIRS）的作用机制。

CD14在LPS的致炎过程中的起着关键作用，如何对其进行人为的调控，已成为抗内毒素治疗研究的重要领域之一。在发生脓毒症或感染性休克时，阻断CD14的功能，可以抑制机体对病原微生物的固有免疫反应。我们认为抗人CD14单克隆抗体2F9的一系列基因工程抗体是治疗脓毒症和全身炎症反应综合症（systemic inflammatory response syndrome ，SIRS）等CD14相关性疾病的重要生物治疗手段。与人鼠嵌合抗体比较，CDR（complementary domain region, CDR）移植抗体不仅最大程度的保留了抗体识别和结合特异性抗原的能力，更是去除了90%以上的鼠源性蛋白序列，从而使抗体的免疫源性得到进一步降低。.该项目完成目标载体的构建以及在CHO细胞高效且稳定表达目的基因工程抗体的真核表达系统；获得高亲和力的CDR2F9抗体，其分子大小约约160 kDa；通过动物实验证实CDR2F9在脓毒症有一定的治疗作用。阳性对照注射1500μg/kg的LPS，阴性对照注射0.5ml无菌生理盐水，Hu2F9治疗组注射1500μg/kg的LPS和1μg的Hu2F9，治疗组在第四周小鼠存活率仍然有80%，而阳性对照组全部死亡，观察到目的抗体对LPS诱导的脓毒症小鼠具有治疗作用。Hu2F9可能部分下调TLR4和5的表达，从而使IL-6、10和TNF-α均出现不同程度下降，治疗组对比阳性对照组IL-6、10和TNF-α均有统计学差异（P<0.05）。Hu2F9可能通过与LPS竞争CD14结合位点，从而减轻全身炎症反应综合征以及细胞因子的表达。该项目初步研究了Hu2F9在LPS诱导的脓毒症中的治疗作用，为脓毒症的生物介质治疗，比如免疫吸附柱的体外血液净化治疗脓毒症、人源化抗体阻断革兰阴性菌的全身炎症反应等提供了研究基础。后期仍然需要对该抗体的表达体系进一步完善，提高表达效率，对其在LPS诱导的脓毒症中的治疗机制以及免疫原性等副作用展开进一步的研究。