VDR在脓毒症免疫抑制中的作用及其机制研究

Immunosuppression is the leading cause for sepsis patients during middle and late stages. Therefore, it is very important to investigate the role and molecular mechanism of immunosuppression. Vitamin D receptor (VDR) -mediated autophagy is reported to be involved in sepsis. Previously, we found siRNA against VDR could reversed endotoxin tolerance, and interference of autophagy also affected cytokines release from endotoxin tolerance cells.. Therefore, herein, VDR agonists and antagonists, siRNA against VDR will be used to observed the changes of important signal molecules of LPS/TLR4 signal pathway, key molecules for autophagy, bacterial clearance ability of cells, and even influence on AS in order to make sure the relationship between VDR-mediated autophagy and immunosuppression. Meanwhile, new targeted genes also will be predicted by bioinformatics and subsequently confirmed in vitro. Mice cecal ligation and puncture (CLP) model will be established, the reaction of mice to second bacterial hit will be observed after they are accepted VDR agonists and antagonists, RNAi against VDR or knockdown of VDR. to confirm the results from in vitro experiments. Our results will try to elucidate the pathophysiologic mechanisms of immunosuppression during sepsis and look for new drug targets to treat immunosuppression of sepsis.

免疫抑制是导致脓毒症中晚期病人死亡的主要原因，研究其发生机制具有重要意义。有文献报告维生素D受体(VDR)介导的自噬参与脓毒症发生。我们前期发现，针对VDR的siRNA可逆转细胞的内毒素耐受状态，干扰细胞自噬可降低细胞释放细胞因子水平。提示，VDR在免疫抑制中发挥关键作用，自噬也与免疫抑制密切相关。为此，本项目在细胞模型中，采用VDR激动剂、拮抗剂或针对VDR的shRNA，观察LPS/TLR4信号途径中重要信号分子、自噬关键分子和清除细菌能力的变化，以及对AS作用的影响，明确VDR调控的自噬与免疫抑制之间的关系；预测VDR的可能靶基因并加以验证，以期发现新的VDR靶基因。在小鼠CLP模型中，在给予VDR激动剂、拮抗剂的小鼠或VDR/自噬相关基因/新基因敲除或RNAi封闭小鼠上，观察小鼠对细菌二次打击的反应性，验证体外实验结果。为阐明脓毒症免疫抑制的病理生理机制奠定基础。

脓毒症是急重症患者的常见和严重并发症，迄今缺乏针对性治疗措施。免疫抑制是中后期脓毒症患者的主要表现和首要致死因素，研究其发生机制、发现新的药物靶点具有重要意义。本项目基于前期研究发现，提出维生素D受体（VDR）参与内毒素耐受状态形成（天然免疫系统中的免疫抑制）并作为青蒿琥酯逆转内毒素耐受关键分子靶点的研究假说。为此，本项目首先观察VDR表达或活性变化对自噬和免疫相关基因表达以及对青蒿琥酯（AS）逆转内毒素耐受作用的影响。其次分别从胞膜VDR调控CaMII-IP3R-CaMKKβ-AMPK通路及其影响Unc-51样自噬激酶1（ULK1）不同位点磷酸化和胞浆VDR结合转录因子NF-κB，抑制其活化两方面探讨VDR的免疫抑制机理，并同步研究AS靶向抑制VDR活化，恢复巨噬细胞自噬、逆转内毒素耐受和增强细胞杀菌活性的分子机制。最后在脓毒症模型中验证了AS通过靶向VDR逆转免疫抑制的体内活性。经上述研究，本项目发现，VDR参与内毒素耐受状态形成，也是AS发挥逆转作用的关键靶点分子。其次，胞膜VDR通过激活CaMII-IP3R-CaMKKβ-AMPK通路，介导ULK1抑制性磷酸化位点过度活化，导致巨噬细胞自噬障碍与内毒素耐受发生。同时，胞浆VDR还可结合NF-κB，抑制其转位入核，从转录水平抑制细胞自噬和免疫功能。AS通过直接结合作用靶向抑制VDR，阻断其活化CaMII-IP3R-CaMKKβ-AMPK通路，解除其对NF-κB的抑制作用，进而恢复自噬与逆转内毒素耐受。在内毒素耐受和CLP脓毒症小鼠模型中，AS通过抑制VDR及其下游信号分子活化，发挥逆转免疫抑制和增强模型动物对细菌二次打击耐受能力的药理作用。通过上述研究，本项目明确了VDR参与脓毒症免疫抑制和作为AS逆转免疫抑制作用药物靶点的分子机理，为阐明AS的药理机制、发现脓毒症免疫抑制防治靶点提供了新证据。