基于CRISPR/Cas9技术敲除的ftsZ细菌研究肽聚糖循环关键酶MpI的分子调控机制

Murein peptide ligase (MpI) is one of pivotal enzymes in the process of peptidoglycan recycling while the mechanism of molecular regulation remains unclear. We unexpectedly detected high repetition rate of peptidoglycan and Low resistance along with a significant up-regulation of MpI in the ftsZ-deficient escherichia coli generated by the clustered regularly interspersed short palindromic repeats cas9（CRISPR/Cas9）strategy. Thus, the goal of this study is to clarify the molecular mechanism of FtsZ influence peptidoglycan recycling via MpI. First of All, to determine whether MpI mainly mediates peptidoglycan recycling caused by FtsZ difficiency, we are going to inhibit MpI in the ftsZ-deficient escherichia coli for rescuing the peptidoglycan recycling and resistance. In the ftsZ-deficient escherichia coli, our previous data showed that there was not significant change in the mRNA level of mpI compared with the wild escherichia coli, suggesting that FtsZ doesn’t influence the transcription regulation of mpI. According to the bioinformatics analysis of FtsZ which potentially directly interact with MpI, we assume that FtsZ would like to take effort on the expression level of MpI by degradation way. In this study, we plan to apply mass spectrometry, Co-Immunoprecipitation (Co-IP) with pull-down to confirm the direct interaction between FtsZ and MpI, meanwhile predict to other potential proteins may interact with FtsZ. Ultimately, we want to illuminate the specifically posttranslational modification of FtsZ towards MpI thoroughly by the experiments of ATPases associated with diverse cellular activities proteasome (AAA+ proteasome) and like ubiquitin-proteasome.

胞壁肽连接酶（MpI）为肽聚糖循环过程中的关键酶之一，其分子调控机制不清楚。我们在CRISPR/Cas9技术构建的ftsZ敲除大肠埃希菌中发现其肽聚糖循环增强和耐药性降低，且伴随MpI表达上调。本课题研究FtsZ通过何种分子机制调控MpI表达并影响肽聚糖循环和耐药性。拟在ftsZ敲除细菌中抑制MpI酶，检测其肽聚糖循环和耐药性是否得到纠正，明确FtsZ是通过MpI这个环节来影肽聚糖循环和耐药性。我们前期实验表明，FtsZ并不是以转录调控方式影响MpI表达；生物信息学分析FtsZ和MpI存在潜在相互作用，提示FtsZ可能以翻译后蛋白修饰方式调控mpI的表达。我们将用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP)、质谱分析以及pull-down等技术首先验证FtsZ和MpI之间是否真实存在直接相互作用；其次分析和FtsZ可能作用的其他蛋白。通过AAA+蛋白酶、原核生物类泛素蛋白酶体等降解调控实验，探明FtsZ对MpI修饰方式。

多重耐药菌的耐药菌的广泛流行是危害公共健康的主要原因之一，临床实践已经证实传统的抗生素对多重耐药菌的疗效甚微，这迫使我们研发新型抗生素或者新型生物制剂以应对当前“无药可用”的窘境。在本项目的研究中，首先我们发现肽聚糖循环与细菌（尤其是革兰阴性杆菌）的耐药性息息相关，当敲除肽聚糖循环关键基因nagZ后，细菌的抗性明显减弱，在nagZ敲除菌中过表达NagZ后，细菌的抗性得到明显恢复，进一步研究发现，NagZ的水解产物可结合并激活转录因子AmpR，活化的AmpR可启动β内酰胺酶AmpC的表达，因此本项目证实肽聚糖循环通过NagZ→NagZ水解产物→AmpR→AmpC途径调控细菌的抗性，此研究结论有望为感染性疾病的的治疗提供新思路，如用NagZ小分子抑制剂联合抗生素治疗多重耐药菌的感染；其次我们发现低浓度的头孢唑啉和亚胺培南可诱导AmpC的表达，而在nagZ缺失的细菌中，这种诱导作用缺失，研究结果提示对于产可诱导AmpC菌的感染应慎用头孢唑啉和亚胺培南；最后我们研究了新型抗生素头孢他啶/阿伟巴坦对多重耐药菌的疗效，并推荐了头孢他啶/阿伟巴坦纸片稀释法的折点。利用本项目的研究基础，我们还证实肽聚糖循环、细菌毒力以及噬菌体抵抗之间的存在一定联系，这为后续研究细菌毒力奠定了良好基础。此外在本项目的研究中，我们对重症呼吸科耐药菌的抗性迁移进行了研究，研究结果有助于控制院感、遏制耐药菌流行。本项目研究成果已发表SCI论文3篇（其中2篇中科院2区top期刊，1篇中科院3区期刊）、2篇中文期刊，另有1篇SCI论文正在修回。培养全日制研究生2名和在职研究生1名，培养2名本科生进入学校科研之星计划，其毕业论文获优秀毕业论文奖。