酪氨酸酶及相关调控基因在长牡蛎幼虫Ⅰ期胚壳发生中的功能研究

Ⅰ期胚壳的发生是长牡蛎个体发育中的重要事件，其发育机制尚未明确。Ⅰ期胚壳的主要成份是角质层，根据对成体软体动物的相关研究，贝壳角质层形成的关键酶是酪氨酸酶。明确酪氨酸酶在长牡蛎Ⅰ期胚壳的发生中的功能和调控机制对我们深入了解软体动物基因间及细胞间的相互作用、发育、进化等理论问题有重要的推动作用。申请人在前期工作中利用生物信息学手段从长牡蛎幼虫及外套膜消减文库中检索到4条与酪氨酸酶同源的EST序列，并对部分序列进行了PCR验证。本研究拟以此为基础，克隆长牡蛎酪氨酸酶的全长序列，综合利用整装原位杂交、整装免疫组化、RNAi等现代分子生物学手段对酪氨酸酶在长牡蛎Ⅰ期胚壳发生发生过程中的作用进行解析；同时通过对相关调控基因（丝氨酸蛋白酶及其抑制剂等）与酪氨酸酶原互作的研究，阐明酪氨酸酶的激活机制。

酪氨酸酶基因可能在成体贝壳的生长中发挥了重要的作用，然而软体动物幼虫贝壳发生的分子机制尚不清晰。我们基于贝类幼虫贝壳与成体贝壳在成份上的相似性，研究了长牡蛎酪氨酸酶基因在幼虫贝壳发生中的作用。我们从长牡蛎中克隆了4个酪氨酸酶基因，并从中筛选到一个参与贝壳发生的基因cgi-tyr1。该基因首先在担轮幼虫中检测到表达，其表达模式与新生贝壳的形状吻合良好。在由担轮幼虫至D形幼虫的发育过程中，cgi-tyr1的表达严格限定于贝壳发生区域，并逐渐由全贝壳表达过渡到只表达于贝壳外缘和铰合部。在发育完成的D形幼虫中，cgi-tyr1的表达关闭，提示它特异性地在贝壳发生的极早期发挥功能。为了研究基因功能，我们在长牡蛎幼虫中成功建立了RNAi技术平台。利用RNAi抑制cgi-tyr1基因的表达后，幼虫贝壳产生明显的表型变化，表明cgi-tyr1参与了贝壳的形成。同时我们还发现被干扰后的幼虫在更长时间的培养后，贝壳发育恢复。除可能的技术原因外，我们认为应可能有其它类似的分子代偿性的弥补了cgi-tyr1基因的功能，如漆酶等。我们最近的研究的确筛选到了这些分子。截至项目启动时，国内外尚无酪氨酸酶与幼虫贝壳发生相关性的报道。我们所克隆的cgi-tyr1是国际上第一个报道的可能参与软体动物幼虫贝壳发生的酪氨酸酶基因，对理解贝壳的演化来源有重要的参考意义。RNAi技术在软体动物发育生物学研究中报道甚少，而且其依赖与显微注射的特点使其其仅仅在具备较大卵细胞的物种中有应用的可能。我们开发的RNAi技术平台可以应用于较小的卵细胞，有望在本领域研究中广泛应用。.我们还研究了长牡蛎幼虫贝壳发生的调控基因。利用差异蛋白质组学的方法，筛选了幼虫贝壳发育的关键时期表达变化的蛋白。通过对这些差异蛋白进行了进一步的研究，成功筛选到两个未被报道过的贝壳发生调控基因。与此同时，我们还研究了包括dpp、engrailed、ferritin等基因等在幼虫贝壳发生过程中的表达情况，揭示了其与幼虫贝壳发生的相关性。对于dpp基因在腹足类和双壳类软体动物贝壳发生中是否存在功能差异一直存在争论，针对这个问题，我们将研究深入到dpp的下游基因smad。结果表明TGF-β/Smad信号通路应该参与了幼虫贝壳发生的不同时期。这些工作为揭示软体动物幼虫贝壳发生的分子机制提供了基础支撑，并为软体动物发育生物学研究提供了技术支持。