一种依赖仿生辅酶的脱氢酶进化系统的建立和分子识别机制

The biggest obstacle in vitro biosynthesis is to use cofactor in enzyme-catalyzed reaction. Alternative to the expensive natural cofactor with some simple biomimietic cofactors will lead to a major breakthrough in the industrial application of oxidoreductase-catalyzed reaction. The project to design a series of biomimetic cofactor moleculars containing the hydrogen ion transfer activity center structure (1,4-dihydronicotinamides) were used as a candidate cofactor. Glucose dehydrogenase(GDH) derived from B. megaterium was used as a model protein and a great amount of GDH mutant genetic library was constructed with error-PCR and DNA-shuffling methods. Mutant GDHs recognizing biomimetic cofactor were screened on platform containing biomimetic cofactor NMN+ and substrates. On the basis, a common directed-evolution system was constructed to screen mutant dehydrogenase recognizing biomimetic cofactor. Kinetic parameters of mutant.GHD-catalyzing reaction with biomimetic cofactor and substrate were analyzed and reaction condition was optimized. The structure-activity relationship was build basing on connection mutant GDH protein structure with recognizing site of biomimetic cofactor and recognizing mechanism of mutant GDH was recovered. The new methodologies obtained from this project will be applied to design simple and.efficient biomimetic cofactor in industrial application of dehydrogenase-biocatalyzed reaction.

辅酶利用问题是体外生物合成工业化应用的最大障碍，用简单的仿生辅酶替代昂贵的天然辅酶应用于酶催化的氧化还原反应是酶工业化应用的一大突破。本项目拟设计一系列具有氢离子转移活性中心1,4-二氢烟酰胺结构的仿生辅酶分子作为候选辅酶，以来源于海洋的巨大芽胞杆菌(B.megaterium)的葡萄糖脱氢酶(GDH)为模式蛋白，通过易错PCR、DNA Shuffling技术建立宏量的GDH基因突变文库，在含有仿生辅酶NMN+和底物的筛选平台上，筛选可识别和利用仿生辅酶的突变GDH酶蛋白。在此基础上，建立一个通用的可识别和利用仿生辅酶的脱氢酶直接进化系统。研究突变GDH利用仿生辅酶和底物的酶动力学性质，优化GDH利用仿生辅酶催化反应的条件，建立突变GDH酶蛋白结构与仿生辅酶分子识别的构效关系，阐明突变GDH对仿生辅酶分子的识别机制。以上研究将为设计简单高效的仿生辅酶分子在脱氢酶催化的工业应用方面提供科学依据

随着体外合成生物快速发展和生物酶催化在生物能源、生物材料和医药化学品合成等方面的广泛应用，天然辅酶(NAD(P)+/NAD(P)H)的稳定性和昂贵价格已经成为制约氧化还原酶应用的最大的障碍。采用酶的定向进化技术以及半理性设计方法，通过随机突变和定点突变改变酶蛋白与辅酶结合的活性中心区域的关键氨基酸位点，从而实现酶蛋白对辅酶偏好性的改变进而筛选能够利用结构简单和价格低廉的仿生辅酶的突变酶蛋白。本课题采用上述方法探究改变葡萄糖脱氢酶辅酶偏好性以及利用仿生辅酶的方法，进而研究酶蛋白与辅酶结合的构效关系。.由于葡萄糖脱氢酶作为辅酶再生酶系统已经广泛应用于氧化还原酶催化反应过程辅酶再生，本课题以辅酶依赖的葡萄糖脱氢酶作为模式蛋白，分别采用定向进化和半理性设计两条路线建立改变葡萄糖脱氢酶的辅酶偏好性以及利用仿生辅酶的方法。针对葡萄糖脱氢酶定向进化策略，本课题构建了高效表达外源蛋白的细胞表面展示质粒pET28a-Ag43，用于随机突变葡萄糖脱氢酶表面展示和辅酶偏好性筛选；同时为了从突变文库中高效筛选突变酶蛋白，本课题建立了利用氮蓝四唑(NBT)平板显色法快速筛选改变辅酶偏好性的突变酶蛋白的方法。针对半理性设计的策略，本课题建立了多序列比对辅酶偏好性不同的葡萄糖脱氢酶保守序列并结合酶蛋白结构分析策略，精确定位葡萄糖脱氢酶GDH223的K17位点是决定辅酶偏好性的关键位点。通过对GDH223的K17位点进行定点饱和突变，获得突变体GDH223-K17D对辅酶NAD+活性和偏好性分别提高11倍和6倍，可作为辅酶再生酶系统用于酶催化反应。最后，将此策略用于SsGDH的辅酶偏好性改变，结果发现双突变体I192T/V306I能高效利用仿生辅酶NMN+并分析突变酶蛋白结构和功能关系。本课题建立的改变GDH辅酶偏好性以及对仿生辅酶NMN+利用的方法为将仿生辅酶应用于酶催化和生物合成提供科学依据。