NAD(P)+-依赖型葡萄糖脱氢酶底物识别分子机制研究

The wide substrate spectrum of glucose dehydrogenase limits its application in real-time glucose measurement. However, changes in the substrate specificity of glucose dehydrogenase are still limited by the lack of structural information of enzyme-substrate complex. The project aims to use glucose dehydrogenase LsGDH as the research object to investigate the interactions between the enzyme and the substrates on the molecular level from static and dynamic angles by integrating protein engineering, protein crystallography and bioinformatics methods. The project can be divided into four parts as follows: (1) To obtain enzyme-coenzyme-substrate complex structure information through crystallization, X-ray diffraction and analysis of the nonfunctional mutant of LsGDH which retains the ability of binding substrate; (2) To obtain the interactions information at substrate binding site and substrate entrance channel of LsGDH by molecular dynamics simulations; (3) To clarify the sites significantly affecting the substrate specificity of glucose dehydrogenase by mutating the potential amino acid sites affecting the substrate specificity of glucose dehydrogenase; (4) To elaborate the substrate recognition mechanism of the glucose dehydrogenase based on above- mentioned results. The project can elaborate the essence of the substrate recognition of glucose dehydrogenase on a molecular level, deepen our understanding of the mechanism of protein-small molecule interaction and enable us to develop new ideas. Moreover, the research can provide a reference for engineering the substrate specificity of other enzymes.

葡萄糖脱氢酶底物谱广泛的特性限制了其在血糖即时监测方面的应用。但是对其底物特异性的改造至今仍受限于缺乏酶-底物复合物的结构信息。本项目以葡萄糖脱氢酶LsGDH为研究对象，结合蛋白质工程、蛋白质结晶和生物信息学方法，从静态和动态的角度研究酶和底物之间相互作用分子水平上的细节本质：(1)通过对无活性但保留底物结合能力的突变体进行结晶、衍射和解析，获得酶-辅酶-底物复合物的晶体结构信息；(2)通过分子动力学模拟，获取酶和底物在结合区及底物通道处的相互作用信息；(3)通过对可能影响底物特异性的氨基酸位点进行突变分析，明确起决定性作用的位点。(4)结合上述结果，阐明葡萄糖脱氢酶的底物识别机制。研究成果既有助于阐明葡萄糖脱氢酶底物识别过程中分子水平上的本质所在，也可以加深我们对于蛋白质和小分子相互作用机制细节的理解，拓展我们的研究思路。同时本项目研究结果也可为其他酶的底物特异性改造提供参考。

葡萄糖脱氢酶底物谱广泛的特性限制了其在血糖实时监测方面的应用。但是对其底物特异性的改造至今仍受限于缺乏酶-底物复合物的结构信息。本项目以葡萄糖脱氢酶LsGDH为研究对象，结合蛋白质工程、蛋白质结晶和生物信息学方法，从静态和动态的角度研究酶和底物之间相互作用分子水平上的细节本质。在获得酶和底物复合物的结构信息的基础上，通过分子动力学模拟，获取酶和底物在结合区及底物通道处的相互作用信息，随后通过对可能影响底物特异性的氨基酸位点进行突变分析，明确起决定性作用的位点。研究结果显示，(1) 不同的底物和葡萄糖脱氢酶结合对于酶的二级结构变化较小，没有显著影响，但是会导致酶的三级结构的变化。(2) 和不同底物结合的蛋白内部的氢键以及蛋白和NAD之间形成的氢键数目在模拟过程中变化不大，但是蛋白和葡萄糖之间形成的氢键数目最多，约是麦芽糖、甘露糖、木糖的两倍。随后对于相互结合能的分析结果和氢键分析的结果相吻合，即蛋白质和葡萄糖结合后最为稳定。 (3) 根据模拟过程中残基RMSF值波动大小，对可能涉及到底物通道的两个位点Glu96和Gly259进行了定点突变，对野生型以及突变体E96A和G259A的稳态动力学研究结果发现，Gly259所在的一段loop区，可能在催化过程中起到盖子的作用，而将Gly突变为Ala之后，导致盖子功能部分失效，使得产物和辅酶能够更快的释放，表现在催化活性上则是kcat值的升高。但是这段loop盖子功能的失效并未带来酶和底物的亲和性提升，因此，我们推测可能底物的进入通道和产物的释放通道并不相同。研究成果既有助于阐明葡萄糖脱氢酶底物识别过程中分子水平上的本质所在，也可以加深我们对于蛋白质和小分子相互作用机制细节的理解，拓展我们的研究思路。同时本项目研究结果也可为其他酶的底物特异性改造提供参考。