上皮硫特异蛋白对芸薹属蔬菜芥子油苷代谢调控作用及功能研究

芥子油苷是芸薹属蔬菜具有重要生物学效应的一类次生代谢物质，在黑芥子酶作用下发生水解代谢而生成异硫代氰酸盐、上皮环硫腈和简单腈类等物质，上皮硫特异蛋白（Epithiospecifier protein，ESP）特异地参与这一反应进程，但其在芸薹属蔬菜中对芥子油苷代谢的调控作用及其功能尚待阐明。本项目拟以白菜为材料，在克隆得到ESP基因的基础上，通过原核表达分析重组ESP对芥子油苷代谢的调节作用及影响ESP活性的因素，通过对白菜ESP基因过量表达和RNAi抑制，共同解析ESP对芸薹属蔬菜芥子油苷代谢的调控作用及调控机制；进一步阐明ESP在芸薹属蔬菜对典型性病虫害防御中的功能。这不仅可为提高芸薹属蔬菜对病虫害防御能力提供新的途径，也可为研究芥子油苷及其代谢产物生物学功能提供优良的实验体系。本项目的展开，无论在芥子油苷代谢的理论研究上还是在作物改良的实践上均具有重要意义。

芥子油苷是芸薹属蔬菜具有重要生物学效应的一类次生代谢物质，在黑芥子酶作用下发生水解代谢而生成异硫代氰酸盐、上皮环硫腈和简单腈类等物质，上皮硫特异蛋白（Epithiospecifier protein，ESP）特异地参与这一反应进程，本项目对ESP在芸薹属蔬菜中对芥子油苷代谢的调控作用及其对病虫害的防御功能进行了研究。首先对白菜上皮硫特异蛋白基因（BcESP）进行克隆，结果表明BcESP全长cDNA编码含343个氨基酸的蛋白质，BcESP与拟南芥ESP（AtESP）和青花菜ESP（BoESP）具有很高的相似性，分别达94.7%和95.6%；进一步构建BcESP CaMV35S过量表达载体并通过浸花法转化拟南芥表明，BcESP过量表达拟南芥植株改变了芥子油苷代谢产物组成，其异硫代氰酸盐含量显著降低而腈类物质含量升高；通过转基因的方法在小白菜中过量和抑制ESP表达，阐明ESP在芸薹属蔬菜中对芥子油苷代谢的调控作用，结果表明，BcESP CaMV35S过量表达植株腈类产物如indole-3-acetonitrile提高，而异硫代氰酸盐类产物indol-3-ylmethyl isothiocyanate显著降低，BcESP CaMV35S过量表达植株对菜青虫（Pieris rapae）和芸薹链格孢菌（Alternaria brassicicola）的防御能力降低。通过构建青花菜BoESP CaMV35S过量表达载体并转化拟南芥，对BoESP进行功能验证，结果表明BoESP过量表达改变了芥子油苷的代谢产物组成，与野生型植株相比，BoESP CaMV35S过量表达的拟南芥植株4-methoxy-indole-3-acetonitrile含量增加，而1-isothiocyanato-4-methanesulfinyl-butane显著减少。同时，本项目对芥子油苷-黑芥子酶系统与外源因素互作进行了研究，研究表明盐胁迫处理能通过影响ESP蛋白活性而改变芥子油苷代谢产物的组成与含量，适当浓度的油菜素内酯可能通过调节芥子油苷-黑芥子酶系统而参与植物对外界的防御反应。本项目通过代谢工程方法调节ESP表达而改变芥子油苷代谢产物组成，不仅可以为提高芸薹属蔬菜对病虫害的防御能力提供新的途径，也可为进一步研究芥子油苷及其代谢产物的生物学功能提供优良的实验体系。