CRISPR/Cas9靶向运输系统及其对ALDH2*2基因的修复研究

CRISPR/Cas9 system has been widely used in genome editing of cellular nucleolus, however its application is limited, mainly due to the instability of protein and RNA which requires a vehicle for the delivery. Common vehicles include viral vectors and liposomes, which are often hindered by their low efficiency, lack of selectivity and specificity, and poor bio-compatibility. This research project plans to develop new delivery systems, using G1510A mutation in ALDH2 gene as a model. These new delivery systems include a “vehicle free” system and systems based on nano particles. Designed systems will provide a multifunctional platform, including the properties of targeting, protection against serum protease and nuclease, endosome escaping, etc., as new method for the delivery of Cas9 and guide RNA. Then we plan to design and construct the guide RNA for G1510A mutation in ALDH2*2 gene. Based on these, we will perform in vitro studies on cell assays, using ALDH2*2 expressing cell lines, as well as the in vivo studies with ALDH2*2 expressing mice, to explore targeting ability, repair efficiency, biocompatibility and other properties of our system. The proposed delivery system would provide a new general method for protein delivery, and also provide a theoretical basis for the clinical treatment of ALDH2*2 gene mutation to reduce the incidence of related diseases.

CRISPR/Cas9技术被广泛的应用于细胞内基因变异的修复，然而受限于蛋白质与RNA的稳定性，需要不同载体作为运输工具。最常用的载体包括了脂质体和病毒载体等，这些载体运输效率较低，缺乏选择性，并且常有生物相容性不佳等安全问题。本研究课题计划以ALDH2基因G1510A变异为研究模型，设计发展新的CRISPR/Cas9运输系统。设计的系统包括免载体的运输系统以及基于纳米粒子的运输系统。这些系统将同时包含靶向、保护、促核内体破裂等功能，为Cas9、向导RNA以及模板DNA的运输提供新方法；设计开发针对ALDH2*2基因型的向导RNA，对G1510A变异进行修复；并在此基础上，分别对表达ALDH2*2的细胞以及小鼠进行基因修复的研究，探索我们系统的靶向能力、修复效率、生物相容性等相关性质，从而为蛋白运输提供新思路，并为临床通过修复ALDH2*2基因变异从而降低相关疾病发病率提供理论依据。

点击化学反应被广泛应用于生物大分子，包括蛋白质、DNA、聚糖等的修饰及相应的研究中，具有重要的研究价值和应用前景。在基金项目21708019的资助下，研究按计划进行，经过近三年的研究工作，以多功能点击化学分子为主线，设计合成了集靶向、内体扰动等功能于一体的“无痕”蛋白修饰分子对，实现了Cas9蛋白的修饰，并以血管内皮生长因子（VEGF）为模型靶标，对其DNA进行了有效切割；提出了基于点击化学分子的19F NMR信号变化跟踪生物分子修饰反应进程的策略，设计合成了氟代二苯并环辛炔分子及其衍生物，有效提高了环辛炔的反应活性，实现了多种生物分子修饰的反应进程实时监测，通过新陈代谢标记，构建了细胞壁携带叠氮基团的细菌，并与荧光标记的氟代二苯并环辛炔分子反应，实现了活细菌的荧光标记；以磷酸吡哆醛分子为基础，设计合成了两类不同的吡哆醛衍生物分子：叠氮吡哆醛和羧酸吡哆醛。叠氮吡哆醛中的醛基和叠氮基，可以通过亚胺连接和叠氮炔环加成反应分别形成稳定的共价键，并通过转肽酶A酰肼化修饰，实现了蛋白的定点叠氮化。羧酸吡哆醛则采用羧基与吡啶环桥联，通过多肽固相合成手段，实现了对特定位点的赖氨酸残基进行修饰，所获得的修饰多肽可以进一步与含有酰肼基团的荧光分子反应，实现多肽的定点、正交荧光修饰。这些工作发展了一系列不同的点击化学分子及其在生物正交反应中的应用，为相关研究提供了有力的新工具，对研究生物反应过程、实现反应动态实时观测、发展新的生物大分子定点修饰策略等具有重要意义。发表SCI论文3篇，其中通讯作者论文2篇（Chem. Commun. 1篇，Chem. Eur. J. 1篇），其他作者论文1篇（Nano Research 1篇），申请发明专利1项；获得2018年江苏省“双创博士”计划资助；参加国内学术会议一次；独立培养硕士研究生10人，其中毕业3人，在读7人；联合培养在读博士1人。