CRISPR/CAS9诱导猪基因组损伤修复机制研究及其在精准基因编辑中的应用

With the introduction of genome editing using CRISPR/CAS9 technology, the efficiency of porcine genome editing has been increased dramatically owing to inducing DNA double strand breaks (DSBs) and stimulating repair pathway. However, the efficiency of precise genome editing ( such as knockin, point mutation) was relative low because the DSBs were repaired mainly by error-prone nonhomologous end joining pathway, but not the precise repair pathway-homologous recombination(HR). Many research indicated that the efficiency of precision genome editing could be improved by modulating DNA repair pathways and increasing HR activity. And the DNA repair mehanism differed among different species. Therefore here we intend to study the specific DSBs repair mechanism of pig and find out the key and high efficient factors that control the repair pathway, then improve the porcine precise genome editing with those key targets or factors. The research will help to improve porcine precise genome editing greatly.

CRISPR/CAS9技术通过靶向诱导基因组断裂损伤，启动自身损伤修复通路，使基因编辑猪的效率大幅提高。然而由于介导精准编辑的同源重组修复发生概率远远低于随机剪切插入的非同源末端连接修复，导致CRISPR/CAS9介导基因定点插入、突变等精准编辑的效率仍然较低。大量研究表明，通过调控宿主细胞基因组损伤修复通路，增强其同源重组修复水平，可有效提高精准基因编辑的效率；且不同的物种间DNA损伤修复机制存在一定差异。因此本研究拟应用单细胞和转录组测序技术，揭示猪体细胞及胚胎在Cas9损伤后的特异性修复机制，筛选其高效特异性通路调控元件；并以特异性关键元件为靶点调控修复通路，增强同源重组修复，从而提高猪体细胞及胚胎细胞的精准编辑效率，为精准基因编辑猪的高效制备奠定基础。

CRISPR/Cas9基因编辑猪作为疾病模型或器官移植供体在生物医药中具有重要意义。Cas9基因编辑包含DNA靶向剪切及修复两个过程，不同修复通路产生插入、删除及突变等不同编辑结局，修复是决定编辑结局的关键核心。因此，探究Cas9靶向剪切后的修复通路是实现精准编辑的重要环节之一。本项目应用高通量CRISPR基因编辑技术，在全基因组水平探究猪细胞内Cas9剪切修复通路及关键调控元件，为实现更精准基因编辑奠定基础。首先项目针对猪全基因组设计约11万条sgRNA，通过病毒感染及筛选成功构建高质量猪胚胎成纤维细胞CRISPR基因敲除文库。同时系统评估常用无启动子荧光报告系统在精准编辑评估中的准确性，并进一步设计建立Repair-Seq与高通量文库筛选结合的高精准Cas9编辑报告系统。基于高通量细胞文库及新型报告系统，项目发现猪胚胎成纤维细胞内靶点修复结局呈现系列规律，其中插入编辑中，插入位点主要分布在PAM上游3-4bp或2-3bp，插入大小主要为1bp。短片段删除则均匀分布切割位点两侧，短微同源删除及突变占比较少。编辑结局差异基因及通路富集结果发现，MRE11可显著抑制1bp插入，而ZNF281、PRKACB等显著促进1bp插入。同时结合293T细胞文库的数据发现大量NHEJ促进1bp等短片段插入，而HR及micro HR显著抑制插入。此外，Small Deletion中富集Base excision Repair，而在Large Insertion中富集p53 signaling pathway。同时，GYPC、KIAA1456、PPIAL4E、hsa-mir-4769和TNFRSF10C等显著促进突变产生。以上结果将为进一步提高猪Cas9精准编辑效率提供重要前期研究基础，项目中所建立系列文库及相应大数据分析平台亦将为基因编辑机制研究提供关键的技术及平台支持。