乙肝表面抗原与鱼精蛋白截短体融合蛋白介导siRNA靶向抑制HBV cccDNA的研究

HBV infection is a public health problem worldwide. There are about 100 people die from the virus-induced liver failure, cirrhosis and liver cancer every year. Once HBV infected the cell, it will enter the nuclear of cells to form covalently closed circular DNA(cccDNA), which is called "pool" of HBV replication. Nucleoside drugs could inhibit HBV replication, but could not cleared cccDNA, which is the important reason of poorly antiviral efficacy and relapse of hepatitis B. Therefore, researchers are much concern about how to clear HBV cccDNA. The project plan to construct the recombinant fusion protein of HBsAg and truncated protamine (tp), which have the ability of targeted positioning activity and nucleic acid binding activity. We design the siRNA targeted at the nuclear localization sequences (NLS) of HBV and transport it to the cells infected with HBV by the recombinant fusion protein. The siRNA could inter the cells by endocytosis, and blocking rcDNA transport into the nucleus, which result in inhibiting cccDNA formation. The NLS siRNA can be targeted to the HBV infected tissue or cells, but have no effect on the HBV negative tissue or cells, which can achieve the purpose of specific inhibition of HBV. These will provide a new research perspective to clear the HBV, and provide new strategies for the treatment of CHB.

HBV感染是一个世界性的公共卫生问题,每年约100万人死于HBV所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。HBV感染进入细胞核形成cccDNA成为HBV的复制“池”。核苷类药物可抑制病毒复制，但不能清除cccDNA，这是现有抗病毒药物疗效不佳和停药复发的重要原因。因此如何清除cccDNA是HBV治疗备受关注的问题。本项目设计构建HBsAg和鱼精蛋白截短体（tp）重组融合蛋白，即同时具有靶向定位和核酸结合活性的融合蛋白，利用HBsAg与肝细胞HBV受体结合，tp与DNA结合的双功能特点，将针对HBV NLS的siRNA靶向至感染HBV的靶细胞内吞入细胞，靶向阻断rcDNA转运入细胞核，抑制cccDNA形成。HBsAg可将效应分子靶向至感染HBV的组织或细胞，而siRNA对未感染HBV的组织或细胞无作用，从而实现靶向特异性抑制HBV，为彻底清除体内HBV提供新的研究视角，为HBV感染所致CHB治疗提供新策略

HBV感染以及其导致的肝硬化、肝癌等疾病是一个世界性的公共卫生问题。HBV cccDNA 位于肝细胞核内，是HBV复制的源泉，在HBV 感染慢性化和肝炎复发中具有重要作用，核苷类药物可抑制病毒复制，但不能清除cccDNA，这是现有抗病毒药物疗效不佳和停药复发的重要原因。只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除 CHB患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的终极目标，也是HBV抗病毒治疗备受关注的问题。有研究表明，siRNA有望为治疗CHB开拓一种新的策略。.本项目通过构建HBV preS1和鱼精蛋白截短体（tp）重组融合蛋白，即同时具有靶向定位和核酸结合活性的融合蛋白，利用HBsAg与肝细胞HBV受体牛磺胆酸钠共转运多肽( NTCP)结合，tp与DNA结合的双功能特点，将针对HBV细胞核定位信号( NLS)的siRNA靶向至感染HBV的靶细胞内吞入细胞，靶向阻断rcDNA转运入细胞核，抑制cccDNA形成。研究结果表明， NTCP重组慢病毒过表达质粒稳定转染HepG2.2.15细胞后，该细胞株可以高表达NTCP基因（即HepG2.2.15-NTCP细胞）。HBV NLS siRNAs可以显著抑制HepG2.2.15-NTCP细胞的HBV mRNA表达，HBsAg 和 HBeAg表达水平也显著下降。preS1-tP融合蛋白不仅可以进入HepG2.2.15-NTCP细胞，也可以结合DNA。preS1-tP融合蛋白与NTCP结合，将HBV NLS siRNAs靶向至HepG2.2.15细胞，阻断 rcDNA 转运入细胞核, 抑制 cccDNA 分子的形成，检测发现HepG2.2.15-NTCP细胞内HBV mRNA, HBsAg and HBeAg 的表达水平，以及HBV DNA 和cccDNA 的水平均显著降低。.总之，本研究结果表明，preS1通过与NTCP特异性的结合，可将效应分子靶向至感染 HBV 的细胞，从而实现靶向特异性抑制 HBV 复制,为彻底清除体内 HBV 提供新的研究视角,为 HBV 感染所致 CHB 治疗提供新策略,也将对最终攻克慢性乙型病毒性肝炎具有深远的意义。