LncRNA介导的ceRNA调控网络在MSC影响口腔扁平苔藓免疫炎症反应中的作用及机制研究

Oral lichen planus (OLP) is a chronic inflammatory disease mediated by T lymphocytes and belongs to precancerous conditions. Our previous studies showed that mesenchymal stem cells (MSCs) can secrete a variety of anti-inflammatory cytokines and cooperate with non-coding RNA, such as miRNA, to participate in the OLP process. However, the biological characteristics and immunoregulatory function of MSCs OLP lesions are decreased. Long noncoding RNA (lncRNA), interacts with miRNA and mRNA to form a competitive endogenous RNA (ceRNA) network, which is an important way to regulate gene expression and may play a key role in OLP immunological inflammatory reaction. This project intends to conduct the RNA-Seq analysis of MSCs normal oral mucosa and OLP lesions, screen differentially expressed lncRNA; then to generally draw the regulation map of lncRNA-mediated ceRNA, and determine the specific changes of the lncRNA-miRNA-mRNA network in MSCs, before and after OLP occurrence; finally to validate the changed inflammatory regulation network by using dual-luciferase reporter, RNA overexpression and interference and other techniques, and clarify the function of MSCs and their role in the course of OLP occurrence, development and repair, from lncRNA-mediated ceRNA participating in the gene expression and regulation aspects.

口腔扁平苔藓（OLP）是T淋巴细胞介导的慢性炎症疾病，属于癌前状态。前期研究表明口腔黏膜间充质干细胞（MSCs）可分泌多种抗炎因子，协同miRNA等非编码RNA，参与OLP的病程，但OLP病变中MSCs生物学特性和免疫调节功能下降。长链非编码RNA（lncRNA）可同miRNA和mRNA互作形成竞争性内源RNA（ceRNA）网络，是其调控基因表达的一种重要方式，可能在OLP免疫炎症反应中发挥关键作用。本项目拟对正常口腔黏膜和OLP病变中MSCs进行RNA-Seq分析，筛选差异表达的lncRNA；总体绘制lncRNA介导的ceRNA调控图谱，进而确定OLP病变前后MSCs中特异变化的lncRNA-miRNA-mRNA网络；利用双荧光素酶报告、过表达和RNA干扰等技术，验证变化的网络，从lncRNA介导的ceRNA参与基因表达调控角度，阐明MSCs功能变化及其在OLP发生、发展和修复中的作用。

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）属于潜在的恶性疾病，是由T淋巴细胞介导的免疫相关的慢性炎症性疾病。本项目基于间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在口腔扁平苔藓免疫炎症反应中的作用及机制进行研究，开展了以下工作：首先，提取了口腔扁平苔藓病变组织的间充质干细胞、病变组织旁正常组织的间充质干细胞和正常口腔黏膜组织的间充质干细胞，对这些细胞的RNA进行测序，将测序结果进行生物信息学梳理、解析和预测，选取co-location和co-expression作用的靶基因并集，与差异表达的mRNA进行分析，取各差异比较组合之间差异表达的miRNA与差异靶向的lncRNA；并筛选出差异miRNA与靶向差异的mRNA，明确了调控关系。其次，将筛选出的miRNA-lncRNA和miRNA-mRNA关系对，进行ceRNA关联分析，构建出口腔扁平苔藓病变前后间充质干细胞的lncRNA-miRNA-mRNA网络，并用cytoscape软件作图可视化显示。最后，将口腔扁平苔藓病变组织间充质干细胞和正常口腔黏膜间充质干细胞分别与T淋巴细胞共培养，这些干细胞可以分泌吲哚胺2，3-双加氧酶，并能通过其活性来抑制T淋巴细胞增殖，发挥免疫调节功能。进一步采用EDU标记口腔黏膜间充质干细胞，观察不同浓度EDU的标记效果，筛选最佳浓度。同时完善口腔扁平苔藓的动物模型，将EDU标记的间充质干细胞静脉注射入口腔扁平苔藓金黄地鼠动物模型体内，激光共聚焦显微镜下观察标记细胞在体内的分布情况，结果发现其可以迁移至病损黏膜下方的间充质组织内，并且注射组颊部病变逐渐减轻，证明了间充质干细胞可以促进口腔扁平苔藓动物病损愈合。综合上述结果，本研究筛选出了口腔扁平苔藓病变前后差异表达的lncRNAs，并绘制了lncRNA介导的ceRNA调控图谱，验证了口腔扁平苔藓病变中间充质干细胞的免疫调节功能。所以，间充质干细胞在口腔扁平苔藓的发生、发展和修复中的发挥了重要的作用，利于疾病的愈合。