基于ERF转录因子调控POD基因的菜心木质素生物合成机制研究

The lignification is an important senescing phenomenon of post-harvest Tsai Tai, and POD is one of a key enzyme in the pathway of lignin synthesis. Our preliminary research results show that expression of POD genes in lignin synthesis pathway and ERF gene in Tsai Tai were regulated by ethylene signaling, accompanied with the increased lignin content. Further analysis revealed that POD gene promoter has binding sites for transcription factors ERF, Obviously POD gene expression may regulated by ERF, and the regulatory mechanism need to be verified. Therefore, the regulation mechanism of key gene POD in lignin synthesis pathway by ERF was studied in the project. First, the functional role of POD in lignin synthesis process was researched. By the means of GUS transcription activation, Yeast one-hybrid, ChIP and EMSA assay, the experimental result would showed that the ERF transcription factor could bind to promoter region of PODs in vivo and in vitro. The research results are expected to clarify the regulation mechanism of ethylene in the lignification process of Tsai Tai. Research results of the project will enrich the theoretical system of lignin synthesis, and also provide a new theoretical basis for the control technology of postharvest fruits and vegetables lignification.

木质化是采后菜心衰老的重要现象之一，POD是木质素合成途径的关键基因。项目组前期研究表明，外源乙烯同时上调了菜心木质素合成关键酶POD和ERF转录因子的基因表达，提高了木质素含量，进一步分析发现POD启动子区存在ERF转录因子的结合位点，预测乙烯调控菜心木质素的合成，可能是通过乙烯响应因子ERF调控POD表达得以实现，但作用机制有待验证。因此，本项目拟研究ERF转录因子对菜心木质素关键基因POD的调控机制。首先研究POD在木质素合成中的功能作用；通过ERF干涉、超表达及GUS转录激活手段，研究外源乙烯和ERF转录因子对POD基因的调控作用；研究ERF转录因子的亚细胞定位并通过酵母单杂、ChIP和EMSA等体内、体外实验，明确ERF转录因子与POD启动子的结合机制。研究结果可望阐明乙烯在菜心木质化进程中调控机制。研究成果将丰富果蔬木质素合成的理论体系，也为采后果蔬木质化控制技术提供理论依据。

木质化是采后菜心衰老的重要现象之一，POD是木质素合成途径的关键基因。项目组前期研究表明，乙烯调控了菜心木质素的合成，可能是通过乙烯响应因子ERF调控POD的表达得以实现，本项目主要对作用机制进行了研究。研究内容主要分3部分：1、菜心POD基因功能研究。首先利用拟南芥突变体，对选取的3个POD基因（POD39、POD67和POD69）进行超表达功能互补实验。该基因突变体均表现为发芽迟缓、发芽后生长缓慢。突变体超表达转化后，对三个基因的TI代转化株表型分析表明，均对突变体有恢复作用，POD67基因超表达对突变体的恢复功能最强。2、ERF对菜心POD基因表达的调控作用。构建了菜心响应乙烯基因表达文库，通过酵母单杂技术确定了BnCABYR-binding protein (XM_013788979.2)、ERF1ALX1（XP_009108325.1）、ERF1AL（XP_009130667.1）、ERF1BL（XP_009108096.1）和ERF2L（XP_009128950.1）等6个基因蛋白与POD67启动子区有直接结合作用。然后，通过双荧光素酶活性检测确定ERF1ALX1和ERF1BL对基因有转录激活作用。3、ERF1ALX1和ERF1BL基因功能鉴定。通过ERF1ALX1和ERF1BL基因与GFP基因连接构建35S启动子驱动的植物融合表达载体，转染烟草悬浮细胞的原生质体，确定了2个ERF基因定位在细胞核。将ERF1ALX1和ERF1BL基因在相应突变体中超表达，两者对POD基因表达、酶活和茎木质素含量均有提高，ERF1ALX1超表达植株尤其明显。实验结果为ERF调控木质化关键基因POD的机制，提供了直接证据。研究结论丰富了果蔬木质素合成的理论体系，也为采后果蔬木质化控制技术提供理论依据。