甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因的克隆与功能分析

Rapeseed (Brassica napus L.) is an important oil crops in the world and ranks the first in production among the Chinese oil crops. nap CMS is an endogenous type to the rapeseed and most cultivated varieties possess the nap cytoplasma. Genetic study showed that the fertility restoration of nap CMS is controlled by one to four nuclear genes, depending upon the cultivars used. Using a map-based cloning strategy, one of the fertility restorer gene Rfn was mapped to a DNA region of approximate 13 kb on chromosome N9 of Brassica napus, which contained five predicted ORFs. Based on our previous study, the Rfn gene will be isolated by using comparative sequencing and bioinformatics analysis,together with complementation tests. Further,the functional characterization of the Rfn gene will be done, such as expression pattern analysis, protein active analysis and modification of the transcripts of nap CMS-associated orf222/nad5c/orf139 mtDNA region. Through this project, the Rfn gene with independent intellectual property rights will be cloned and the mechanism for restoring fertility in rapeseed of nap CMS system will be discovered. On the other hand,the newly developed markers, inclued fuctional markers will provide more information to guide the selective breeding of elite inbred lines or cultivars with nap cytoplasma.

油菜是世界上重要的油料作物之一，也是中国第一大油料作物。nap CMS是甘蓝型油菜一种内源的CMS类型，而且大部分油菜栽培品种都含有nap胞质。有研究表明：nap CMS育性恢复性由一到多对基因控制。本课题组通过图位克隆的方法将其中一个恢复基因Rfn定位于甘蓝型油菜N9连锁群约13kb范围之内，目标区域内有5个候选基因。本项目将以此为基础，结合比较测序、生物信息学分析及遗传转化互补验证等完成对Rfn基因的图位克隆，进而通过对Rfn的时空表达、蛋白特性分析及其与线粒体转录本orf222/nad5c/orf139的相互作用分析等揭示Rfn在nap CMS育性恢复过程中的功能。该项目的实施，一方面可以克隆到nap CMS恢复基因，初步揭示Rfn在nap CMS育性恢复过程中的分子机理；另一方面在克隆过程中产生的标记（包括功能标记）可以指导含有nap胞质甘蓝型油菜的自交系或常规品种选育。

油菜是世界上重要的油料作物之一，也是中国第一大油料作物。甘蓝型油菜nap胞质是一种内源的胞质类型，而且大部分油菜栽培品种都含nap细胞质。nap CMS系统不能直接用于杂交种生产，而且只有少部分品种中因不含nap CMS恢复基因Rfn而产生不育。但是在自交系或常规品种选育过程中，如果缺乏nap CMS恢复基因，则会出现低温雄蕊发育不正常、结实率下降的现象，最终导致产量下降，因此，nap CMS恢复基因在甘蓝型油菜育种过程中也起着至关重要的作用。本研究在前期研究的基础上，利用甘蓝型油菜与白菜的共线性关系，筛选并开发出与17个与Rfn紧密连锁的标记。通过对包含5,652个单株的BC1群体进行基因型分析和育性鉴定，将恢复基因限定在甘蓝型油菜约10.5 kb的物理区间内。基因预测分析发现，该区间内包含一个编码PPR蛋白的基因。通过农杆菌介导的遗传转化将Rfn候选基因转入nap CMS不育系中，在获得的阳性单株中有9株在低温条件下能够恢复育性至正常可育表型。利用Rfn基因特异引物对Rfn基因进行qRT-PCR分析，结果表明Rfn基因在所有组织中均有表达，其中在花蕾中的表达量相对较高。Rfn基因启动子GUS转化拟南芥结果也进一步表明Rfn基因在所有组织中均有表达。RNA原位杂交分析结果显示，Rfn基因在花药发育过程中的四分体时期的绒毡层和四分体细胞中表达量较高。亚细胞定位结果表明，RFN蛋白定位于线粒体，符合其发挥功能的细胞器位置。利用orf222和orf139分别做探针，对转基因育性恢复株系中CMS不育相关转录本进行分析，结果显示，转基因育性恢复株系中利用orf222做探针时，其转录本大小和丰度并没有发生明显变化，而利用orf139做探针时，在恢复系和转基因育性恢复株系中产生1条约1.2 kb大小的新的转录本，推测Rfn在nap CMS育性恢复过程中有着复杂的调控方式。本研究为深入剖析CMS育性恢复和核质互作的分子机理奠定了基础。