原生动物嗜热四膜虫减数分裂前期小核延伸的分子调控机制

Meiosis is an essential division for the formation of germ cells during sexual reproduction, the onset of meiosis is the key regulation step during meiosis. Although there is precise description for the dynamic change of chromosomes during meiotic progress, the molecular mechanism is not clear for the process. Ciliated protozoa Tetrahymena thermophila are unicellular organism with two nuclei, a diploid micronucleus as the germ line and a polyploid somatic macronucleus. Tetrahymena forms specific elongated “Crescent” structure during the first meiotic prophase. The elongated structure is an excellent model for exploring the molecular mechanism of meiotic onset. In this study, we will first screen cyclin genes expressed highly during micronuclear meiosis stage by Tetrahymena gene expression profiles and bioinformatic analysis. Then, HA/V5/Flag/GFP-tagged cyclins mutant cells will be constructed and dynamic localization of the tagged protein will be obtained by immunofluorescence staining. The function of the cyclins will be analyzed by gene knockout, RNAi, and gene overexpression. Furthermore, cyclin interaction protein encoding genes will be identified by the comparation of transcriptome sequencing between the mutant and wild type lines. The physical interaction of different poteins will be established by co-localization and co-immunoprecipitation methods. Based on the date, the molecular regulation mechanism of the meiotic onset and micronuclear elongation will be established in Tetrahymena. The study will explore our understanding for molecular mechanism of the meiotic onset in eukaryotic cells.

减数分裂是有性生殖过程中生殖细胞形成所必需的分裂方式, 减数分裂起始是减数分裂过程中的关键调控环节。目前，对多种高等真核生物减数分裂起始过程染色体的动态变化已有精确描述，但减数分裂起始的分子调控机制并不清楚。纤毛类原生动物嗜热四膜虫具有核的二态性，小核在减数第一次分裂前期延伸形成独特的“Crescent”结构。本研究通过嗜热四膜虫基因表达谱和生物信息学分析，筛选减数分裂时期高表达的周期蛋白基因。利用免疫荧光定位分析候选周期蛋白的定位模式；通过基因敲除、RNA干扰和基因过表达分析特异周期蛋白对四膜虫小核减数分裂“Crescent”发生的影响。通过突变体和野生型细胞减数分裂初期转录组表达差异，鉴定出周期蛋白相关基因，免疫荧光共定位和免疫共沉淀技术分析周期蛋白与候选基因之间的相互作用。由此建立四膜虫减数分裂起始的分子调控机制，为深入了解真核生物减数分裂发生的分子调控机制提供新的理论依据。

减数分裂前期同源染色体匹配和重组是使后代获得新的遗传性状的关键阶段。在此时期，染色体延伸形成保守的bouquet标志性结构。尽管对bouquet形成有众多的分子机制研究，但其细节仍不清楚。四膜虫是一种含有两个细胞核的单细胞真核模式生物。大核是营养核，小核是生殖核。在减数分裂前期，小核经极度拉伸形成类似于bouquet的crescent结构。但目前对其分子调控机制并不清楚。周期蛋白作为调节亚基与其相应的催化亚基周期蛋白依赖性激酶对减数分裂过程中的多个检验点进行调控。本项目以嗜热四膜虫为研究材料，通过构建周期蛋白基因CYC2和其它相关基因的表达构建体、大核敲除构建体和过表达构建体，基因枪转化和筛选，获得各种突变细胞株。对它们在四膜虫有性生殖过程中的定位和发育进行分析发现，周期蛋白Cyc2主要定位在细胞质和小核上。可能与其相互作用的周期蛋白依赖性激酶Tcdk2(Cdk3) 定位在细胞质中。在ΔCYC2和ΔCDK3的突变细胞株中，小核延伸停滞在发育早期，无法形成crescent。进一步研究发现：在ΔCYC2突变株中，染色体无法断裂，染色体断裂修复相关基因SPO11、DMC1和RAD51的表达下调；核周微管延伸萎缩，与微管相关的驱动蛋白基因KIN11和KIN141表达明显下调；H3K23甲基化在小核中的沉积加剧，EZL3的表达量增加；着丝粒在stage II之后的分布异常。这些结果通过转录组测序和qRT-PCR分析得到进一步验证。综上所述认为，周期蛋白Cyc2调控染色体断裂、核周微管的动态变化、H3K23甲基化在小核中的沉积。而人工诱导染色体断裂后仍然无法让小核恢复延伸，ATR基因在ΔCYC2突变细胞株中表达无明显变化，及小核着丝粒簇集在小核延伸初期并未受到影响等表明：Cyc2, ATM/ATR激酶通路和着丝粒簇集三条通路共同调控减数分裂前期小核的延伸。此外，小核的延伸与否基本不影响与新大核DNA重排的RNAi机制相关的scanRNA的产生。这为研究小核发育成大核的机制提供了新的科学数据。总之，通过对四膜虫周期蛋白Cyc2及其相关基因的功能分析，对减数分裂前期核发育的调控机制有了进一步深入的了解，为今后的减数分裂机制研究奠定了科学的基础。