以纤毛虫原生动物－嗜热四膜虫为模式：DNA复制延伸相关的表观遗传学研究

Previous studies have shown that DNA replication is highly cooridinated with histone deposition. However, the epigenetic mechanism regulating DNA replication is still not clear because we know little about which epigenetic marks, including histone PTMs (post-translational modifications) and histone variants, are involved in DNA replication, not to mention their distribution along chromosomes. Recently, the applicants and colleagues revealed that DNA replication elongation is severely impaired by deficiency of H3K27me1, which is the first to show that perturbation of epigenetic information can directly affect replication elongation. In this proposal, we will use the ciliated protozoan - Tetrahymena thermophila - as a model organism, to investigate the involvement of additional epigenetic factors in this pathway that couples propagation of both genetic and epigenetic information. In brief, mono-nucleosomes will be purified by MNase (micrococcal nuclease) digestion and sucrose gradient centrifugation. Using mono-nucleosome as input, chromatin immunoprecipitation (ChIP) will be performed with specific histone modification antibodies or affinity tag antibodies, the purified samples from which will be analyzed by deep sequencing. This will allow us to provide the first high-resolution genome-wide distribution maps for various epigenetic marks, and most importantly, by comparing the distribution patterns of epigenetic and genetic (DNA replication) factors, we will be able to determine epigenetic factors involved in replication elongation. Further cell biology and biochemical investigations will help to dissect the pathway and provide deep insight into the molecular basis for epigenetic regulation of DNA replication.

大量研究显示，DNA的复制延伸与组蛋白嵌入及核小体组装过程高度相关。但迄今对表观遗传因子与DNA复制相互作用机理的了解高度匮乏，尤其对组蛋白转录后修饰以及变体如何参与该复制的过程欠缺了解，这也构成了当今表观遗传学研究的热点问题之一。申报人最近以四膜虫为模式动物，刻画了H3K27me1特异性敲除对DNA复制延伸的影响等并取得了富有意义的发现。本项目拟在此基础上开展如下研究：1）以四膜虫单核小体为内参，借助染色质免疫共沉淀-高通量测序等方法，构建多种表观遗传因子的全基因组分布图谱；2）在高通量测序信息基础上，比对已知DNA复制起点图谱，筛选参与该复制过程的关键因子；3）利用基因敲除和标记技术，探讨和阐明参与复制延伸过程的关键因子；4）在上述工作基础上，揭示表观遗传信息影响DNA复制上下游通路的调控机制。本研究将为解答"表观遗传信息影响DNA复制的作用机制"这一科学命题提供重要的佐证和新的认知。

真核生物染色体DNA的精确复制对于维持基因组的完整性至关重要，复制异常将导致基因组的不稳定，进而导致细胞凋亡、癌变甚至细胞的死亡。我们在前期工作中发现，对四膜虫中H3K27单甲基化酶TXR1的敲除可直接影响DNA复制延伸,细胞中形成巨大的复制压力，表明表观遗传信息的变化可导致基因组的不稳定性。但迄今为止表观遗传信息如何参与复制延伸过程高度不明。本项目聚焦DNA复制延伸过程的精准调控过程，以单细胞真核模式生物四膜虫为材料，重点探究复制延伸与核小体分布以及组蛋白翻译后修饰之间的内在联系，开展了如下工作：1）核小体纯化方法优化：探索了稳定高效分离、提纯四膜虫中大、小核的条件，为后续试验提供了稳定可靠的试验材料。同时，优化了微球藻核酸酶酶切条件及蔗糖密度梯度超速离心的试验方案，将四膜虫的核小体占位分辨率提高至单核小体水平，为后续全基因组研究提供了重要基础；2）四膜虫核小体分布的决定性因素探讨：分别对大核和小核的单核小体样品进行了高通量测序，并利用自编脚本进行了核小体占位和定位分析。利用四膜虫大小核序列的高度相似性和转录活性的不同，对顺式元件（cis-element，DNA序列）和反式元件（trans-element，转录活性）在核小体分布中的作用进行了探讨，发现顺式元件和反式元件对于核小体的分布具有协同调控作用上述结果为顺式和反式作用元件共同决定核小体占位的理论提供了直接证据，推动了对真核生物染色体环境决定机制的认知。3）复制相关因子的筛选：对多种组蛋白变体及组蛋白翻译后修饰的全基因组分布模式进行了研究，并与前期工作中获得的全基因组复制起点图谱进行比较分析发现，H3K27me1集中于基因的3’端且与转录活性标记呈“谷状”负相关，表明H3K27me1可作为“边界地标”调控转录终止；H3K27me1在复制起点两侧形成双峰分布，表明TXR1敲除细胞的复制缺陷是由于H3K27me1缺失造成的转录终止受损引起的基因复制冲突造成的。4）四膜虫表观遗传信息平台的搭建：通过对已有数据、本项目新获得数据以及同步开展项目所获得数据的整合，搭建了四膜虫表观遗传信息平台，并编写和完善了多项个性化的数据分析脚本，为相关分析及后续研究奠定了基础。