水牛瘤胃内热原体属甲烷菌的FISH－FACS分离技术构建及其代谢功能分析

Inhibition of methanogen in rumen of ruminants is the main way to decrease methane emission from ruminants. Rumen Cluster C methanogen which is a kind of methanogen belong to Thermoplasmatales occupied the ecological niche which use methyl products in rumen to produce methane; they are one of the important methane producer in rumen. The manipulation of ruminal methanogen composition and their metabolic process are based on the metabolism and physiological characteristics of RCC, which is very important for mitigation of methane emission. This project will enrich buffalo ruminal RCC methanogen by cultivation and isolated them by FISH-FACS technology, then use MDA techniques to amplifiy genomic DNA and analyze it with metagenomic methods, such as sequencing and gene annotation. At the same time, the metabolic function diversity of RCC, such as the utilization of RCC on different carbon source, will be investigated. At the end of this project, the methods of ruminal RCC methanogen separation and analysis system will be constructed, and the ruminal RCC methanogen characteristics will be explored, and this information can be used as technology support and theoretical guidance for further investigation and manipulation of buffalo methanogen.

调控瘤胃中甲烷菌的组成与代谢过程，是减少反刍动物瘤胃甲烷生成的重要途径。瘤胃热原体目甲烷菌（又叫rumen cluster C,RCC)）占据着甲烷生成中甲基产物利用的生态位，是瘤胃甲烷的重要甚至是主要生产者。探明瘤胃RCC甲烷菌生理代谢功能特点是调控瘤胃甲烷菌的组成及其代谢过程的重要理论基础，对减少甲烷生成具有重要实际意义。本研究通过对水牛瘤胃内Rumen Cluster C(RCC)甲烷菌的富集培养，采用荧光原位杂交-荧光激活分选技术（FISH-FACS）分离瘤胃RCC，应用全基因组多重置换扩增技术（MDA）扩增基因组DNA并进行宏基因组测序、分析和基因注释，以及RCC甲烷菌对不同碳源利用方式等代谢功能多样性的研究，最终构建瘤胃RCC菌的分离方法体系，并阐明瘤胃RCC的代谢功能特点，进而为水牛甲烷菌群的系统研究提供技术支持，并为水牛瘤胃甲烷菌群的调控提供理论依据。

瘤胃热原体目甲烷菌（又叫rumen cluster C, RCC）是瘤胃甲烷的重要生产者，探明瘤胃RCC甲烷菌生理代谢功能特点是调控瘤胃甲烷菌的组成及其代谢过程的重要理论基础，对减少瘤胃甲烷生成具有重要意义。本研究利用16S rDNA克隆文库技术分析了河流型水牛和役用型水牛瘤胃甲烷菌结构组成，证实水牛瘤胃液中产甲烷菌以Methanobacteriales目为主，其次是，而RCC数量极少。其次，以山羊为试验对象，分析了山羊不同日龄的甲烷菌群结构、测定甲烷产量等，结果表明，羔羊出生后第一天即有产甲烷菌在液相食糜和瘤胃上皮中定植，随着固体饲料引入和早期断奶，产甲烷菌丰度逐渐稳定。证实日粮中添加纤维素及酵母培养物可降低肠道CH4排放，但是山羊的瘤胃发酵、甲烷菌多样性、营养物质表观消化率、N平衡和能量平衡并不受影响。比较了补饲和放牧两种饲养方式对不同日龄羔羊瘤胃液甲烷菌区系的影响，结果表明，无论是何种饲养方式，甲烷菌均在1周内开始定植，Methanobrevibacter为绝对优势属，Methanimicrococcus、Methanomicrobium 和Methanosphaera 属含量较低（<5%），而Rumen cluster C含量较高（>15%）；本项目还建立了水牛瘤胃微生物总DNA提取以及RCC real-time PCR检测方法，证实酚/氯仿/异戊醇法提取水牛瘤胃微生物总DNA效果最佳。在BRN培养基中添加不同底物（甲醇、一甲胺、二甲胺、三甲胺）进行厌氧传代培养，利用气相色谱进行甲烷产量测定和定量PCR法对RCC菌株拷贝数进行测定，结果表明三甲胺组甲烷产量及RCC数量显著高于其他组。由此可以推测出，添加三甲胺有利于RCC的富集培养。对水牛瘤胃RCC簇甲烷菌荧光原位杂交探针设计及杂交条件进行了摸索，在经过反复试验后，仍无法观察到荧光标记的RCC菌株，其原因未知。对富集培养后的RCC样品进行高通量测序。结果表明，与未添加任何添加剂的对照组相比，在目水平上三甲胺组中Synergistales成为了优势菌,其次是Clostridiales和Petrotogales.甲烷菌只有Methanomicrobiales是主要古菌，而RCC可能数量过少，需要进一步单独挖掘数据来对比分析。在不同粗饲料（青贮玉米、稻草、象草、甘蔗梢）体外发酵条件下,水牛瘤胃甲烷菌以Methano