反刍动物瘤胃未知甲烷菌菌群分析及其分离和特性的研究

In this project, the unknown rumen methanogens (Rumen Cluster C: RCC) will be investigated on their distribution and the law of their community changes in the rumen as well as their isolation and hydrogenotrophic characteristics through animal in vivo trials and microbiology in vitro culture trials. Based on the previous study on the methanogen community structure in the different rumen fractions, the RCC community structure and abundance in the samples of rumen content and rumen epithelium mucosa from the goats fed two diets with different ratios of concentrate will be studied to reveal the distribution and the community changes law of RCC, and the effects of the diets changes on RCC community shift will be discussed;Then,based on the studies above, several RCC strains will be purified through the approach of culturing methanogens with anaerobic fungus from the anaerobic fungus-methanogen in vitro co-culture system established in the previous study;Based on the previous studies on the symbiosis of rumen anaerobic fungi and methanogens, a co-culture model with low hydrogen partial pressure will be established by culturing methanogen with anaerobic fungus (or a hydrogen-producing bacteria),then,the characteristics of the RCC hydrogenotrophy will be investigated using the co-culture model.Finally, the methane production mechanisms of RCC in the rumen will be discussed.These researches are the important bases to develop strategies to manipulate rumen methane production.

拟通过在体试验和瘤胃微生物体外培养试验，研究未知甲烷菌（Rumen Cluster C：RCC）在瘤胃内的分布和菌群变化规律及其分离纯化和氢营养特性。在前期研究瘤胃不同部位甲烷菌菌群结构的基础上，通过研究饲喂不同精粗比日粮山羊的瘤胃内容物和瘤胃上皮黏膜样品中未知甲烷菌RCC菌群的丰度和菌群结构，了解未知甲烷菌RCC在瘤胃内的分布特点和菌群变化规律，探讨日粮模式改变对未知甲烷菌RCC菌群的影响；在此基础上，通过厌氧真菌和甲烷菌共培养途径，从前期建立的厌氧真菌和甲烷菌体外共培养体系中纯化含有未知甲烷菌RCC菌株的共生菌；在前期深入研究厌氧真菌和甲烷菌共生关系的基础上，利用将产氢菌和甲烷菌共培养的方法，模拟瘤胃内环境，建立低氢分压共培养模型，研究和揭示未知甲烷菌RCC菌株的营养代谢特性，探讨未知甲烷菌RCC菌群在瘤胃内的甲烷生成机制，为瘤胃甲烷调控提供理论基础。

瘤胃甲烷生成不仅是饲料能量的损失，还是重要的温室气体来源。对瘤胃甲烷菌的研究可为反刍动物能量利用率的提高以及瘤胃甲烷减排的研究提供理论基础。为了了解瘤胃甲烷菌菌群结构及变化规律，本项目利用高通量测序技术，通过研究饲喂高精料日粮和全草日粮山羊的瘤胃甲烷菌多样性，发现瘤胃内容物中主要有Methanobrevibacter gottschalkii clade、Methanobrevibacter ruminantium clade、Methanosphaera sp. 和Methanomassiliicoccaceae （RCC）四大甲烷菌菌群。与全草日粮相比，饲喂高精料日粮山羊瘤胃的甲烷菌核心菌群未发生更替，只有部分优势菌群的相对丰度发生变化。通过巢式PCR/高通量测序技术，深入研究新建立的瘤胃第二大甲烷菌目RCC菌群结构，发现RCC主要有Group 8、9和10三个属水平菌群。高精料日粮显著降低了瘤胃内容物中RCC的丰度，但没有影响瘤胃上皮中的RCC丰度。利用建立的厌氧真菌和甲烷菌共培养体系富集纯化RCC菌株，结果显示这一方法能够富集纯化RCC，但当纯化到只有一株真菌和一株RCC存在时，共培体系变得不稳定。继续利用与细菌共培养的方法富集纯化RCC。通过研究RCC在细菌培养液中的底物利用特点，发现RCC利用三甲胺合成甲烷的效率最高，以三甲胺为底物能够将RCC菌体浓度提高到90%。利用连续稀释法进一步纯化，获得一株纯RCC甲烷菌LGM-RCC1。LGM-RCC1呈圆球型，直径300-400 nm，420 nm激发光下无甲烷菌特征性自发荧光，能够利用氢气还原甲醇、一甲胺、二甲胺和三甲胺生长。LGM-RCC1生长缓慢，菌体浓度极低。为了提高LGM-RCC1的生长速度，研究了主要营养成分对其生长的影响，发现瘤胃液浓度越高，LGM-RCC1生长速度越快。利用体外瘤胃模拟发酵法，研究了小分子甲烷菌抑制剂对瘤胃甲烷排放和甲烷菌菌群结构的影响，发现抑制剂能够抑制甲烷菌生长，减少甲烷排放，降低RCC甲烷菌的相对丰度。本课题研究结果显示，RCC甲烷菌是中国山羊瘤胃甲烷菌菌群第二大目，利用氢气还原甲基化合物生长，筛选的小分子抑制剂能够有效抑制瘤胃甲烷生成，为瘤胃甲烷调控提供了理论和技术基础。然而，RCC在维持瘤胃生理环境稳定方面的作用还有待深入研究。