PPP2R3A基因突变致家族性扩张型心肌病的分子机制研究

Familial dilated cardiomyopathy is an inherited cardiomyopathy characterized by ventricular chamber enlargement and impaired systolic function. FDCM is the important cause of heart failure,sudden death and the major indication of heart transplantation.The exact pathogenesis of FDCM remains elusive.To date,known genes only explain the genetic background of 50% FDCM cases.We have previously found that PPP2R3A mutation was associated with FDCM.In order to further explore the molecular mechanisms, which will provide the theoreticaland experimental basis for gene diagnosis, an increasing understanding of the pathogenesis and treatment of FDCM.We would like to: 1.screen the new PPP2R3A mutations in 100 DCM probands or sporadic patients; 2.study the effects of overexpression and knockdown of PPP2R3A on cardiomyocyte proliferation and apoptosis; 3.identify the cardiac interacting protein of PPP2R3A;evaluate the effects of PPP2R3A mutations on phosphorylation status of interacting protein and related signaling pathway molecules,which will elucidute the pathogenic mechanism from the molecular and cellular aspects; 4.use PPP2R3A gene knockout mice to simulate the disease phenotype of DCM, then determine the phosphorylation status of interacting protein and expression level of related signaling pathway molecules,which will reveal the pathogenic mechanism in animals.

家族性扩张型心肌病（FDCM）是以心室扩大和心肌收缩功能受损为特征的遗传性心肌病，是心力衰竭、猝死的重要原因和心脏移植的主要适应证。其发病机制不明，迄今发现的致病基因只能解释50％的患者。我们前期实验发现PPP2R3A基因突变与FDCM发病相关。本研究将进一步探讨其分子致病机制，为FDCM的基因诊断、发病机制的认识和治疗提供理论和实验依据。拟：1.在100例扩张型心肌病家系先证者或散发患者中筛查PPP2R3A基因的新突变位点；2.研究PPP2R3A过表达和敲减表达对心肌细胞增殖、凋亡的影响；3.筛选PPP2R3A的心肌互作蛋白，研究PPP2R3A基因突变对互作蛋白磷酸化状态及相关信号通路分子的影响，从分子、细胞水平探讨致病机制；4.利用PPP2R3A基因敲除小鼠，模拟疾病表型，分析病变心肌细胞中互作蛋白磷酸化状态及相关信号通路分子表达情况，从动物水平揭示发病机制。

家族性扩张型心肌病（FDCM）是以心室扩大和心肌收缩功能受损为特征的遗传性心肌病，是心力衰竭、猝死的重要原因和心脏移植的主要适应证。FDCM是一种高度遗传异质性疾病，目前发现的致病基因只能解释约50%的患者，提示存在很多新的未被发现的致病基因，有待收集更多的家系和患者进行深入研究。我们前期实验发现PPP2R3A基因突变与FDCM发病相关。在既定期限内，本项目组基本按照预定的研究目标和进度实施项目。收集到扩张型心肌病散发患者105例，采用PCR-Sanger测序法进行突变筛查，鉴定出3个SNP位点。Ppp2r3a基因敲减表达后，大鼠原代心肌细胞和大鼠心肌细胞株H9c2的细胞增殖活力减低，细胞周期中S期细胞比例降低，早期凋亡细胞比例轻度增加。构建成功人心肌细胞cDNA文库，通过酵母双杂交筛选及阳性克隆鉴定、测序比对，筛选到与PPP2R3A存在相互作用的蛋白总共有19个，包括AXIN1、EWSR1、RGS19等。采用CRISPR/Cas9技术，成功构建PCR和测序鉴定阳性的ppp2r3a基因敲除小鼠。基因敲除小鼠心脏切片HE染色示心肌细胞肥大，排列紊乱。Ppp2r3a基因敲除小鼠中互作蛋白axin1和rgs19的表达增加，ewsr1的表达无明显差异。通过开展临床遗传学、细胞水平和整体动物三个层次的实验，初步探讨了PPP2R3A基因突变致FDCM的分子机制，为FDCM的基因诊断、发病机制的认识和治疗提供了理论和实验依据。到目前为止，在本项目资助下，本课题组发表了1篇中文论文，1篇SCI论文，1篇SCI论文正在审稿，另有2篇SCI论文在准备中；授权国家发明专利1项；项目负责人于2017年2月被遴选为昆明医科大学学术学位硕士研究生指导教师；培养了扩张型心肌病发病机制研究方面的硕士研究生1名，另有在读硕士研究生1名；获得扩张型心肌病发病机制方面的云南省应用基础研究面上项目1项，为本项目的后续研究奠定了良好的基础。