基于薯蓣类皂苷水解途径定向调控技术构建多功能基因工程菌的研究

Diosgenin, a precursor for partial synthesis of oral contraceptives, sex hormones, and other steroids, is widely used in pharmaceutical industry.Sulfuric acid is usually applied in hydrolyzing Dioscorea zingiberensis raw herb to produce diosgenin. This method, however, is associated with many environmental problems resulting from the acid hydrolysis process. Releasing diosgenin through biological transformation is an environmental-friendly technique, but low diosgenin yield of microbial transformation are major drawbacks for their application..In order to develop an effective microbial approach for producing diosgenin, a strategy for analyzing the hydrolyzing pathway from dioscins to diosgenin was presented by conducting fermentation and enzyme catalytic reaction experiments. Based on the strategy，multifunctional genetically engineered strain with three key glucosidase enzyme was constructed by SOE PCR .The influencing factors of the fermentation of genetic engineering strain are studied carefully in the level of transcription and expression of fusion gene to optimize the fermentation condition and analyze genetic stability. .This study provides a new method for gene fusion and an attractive alternative for clean diosgenin production in industry.

薯蓣皂甙元作为合成甾体激素类药物的重要中间体，市场需求量较大。一般利用强酸在高温高压下直接水解薯蓣类皂苷制得。此过程产生大量强酸性废水，严重污染当地环境。生物水解反应条件温和，专一性强，然而较低的水解效率制约了该技术的工业应用。. 针对生物水解法制备薯蓣皂甙元过程中存在的产品得率低，反应时间长的问题。项目通过水解反应与酶促反应动力学模型，建立定向调控薯蓣类皂苷生物水解途径的方法。基于该方法，以皂苷水解关键糖苷酶为对象，采用基因融合技术，构建多功能工程菌，优化皂苷水解酶系，提高水解效率。并在基因转录与表达水平分析主要环境因子对皂苷水解过程的调控机制，确定工程菌最佳水解条件，研究其遗传稳定性。. 研究成果可为多功能基因工程菌的构建提供新的模型方法，同时对推进薯蓣皂甙元加工生产的产业结构升级，消除丹江口水源区的重大环境隐患，保证南水北调中线工程的顺利实施具有重要意义。

为了解决生物水解法制备薯蓣皂甙元过程中存在的产品得率低，反应时间长的问题。本项目首先筛选出三株水解薯蓣皂苷途径不同的霉菌，Trichoderma reesei，Trichoderma vider 和Aspergillus fumigates。从三株霉菌中分离表征出三种水解作用不同的皂苷糖苷酶αRha， βGlu和C3-βGlu。对糖苷酶的全长cDNA进行克隆。采用基因融合技术，构建多功能工程菌，以水解反应与酶促反应动力学模型为指导优化皂苷水解酶系。获得一株降解效率较高的基因工程菌。利用响应曲面法分析环境因子对皂苷水解过程的调控机制，确定工程菌最佳反应条件。结果表明在5.0 l发酵罐中，工程菌发酵24h后添加3% 甲醇，维持发酵温度为35 ºC，调节搅拌速率为250rpm，通气量为1 vvm时，薯蓣皂甙元得率最高，可以达到95.4%。.研究成果可为多功能基因工程菌的构建提供新的模型方法，同时对推进薯蓣皂甙元加工生产的产业结构升级，消除丹江口水源区的重大环境隐患，保证南水北调中线工程的顺利实施具有重要意义。