新型双机制小RNA调控溶藻弧菌碳氮代谢的分子机制

Small non-coding RNA(sRNA) mediated gene regulation plays an important role in modulation of bacteria central metabolism.Our previous study has identified a new dual mechanism sRNA CsrC in Vibrio alginolyticus. it is able to affect the translation of ald encoding alanine dehydrogenase through imcomplement pairing, and function as a “RNA sponge”to control the concentration of the free CsrA that has been regarded as a major player in regulation of carbon metabolism, indicating it may be a switch to control carbon and nitrogen metabolic flux.To test this hypothesis, this project will identify the major metabolism pathways affected by CsrC using metabolic and transcriptomic analysis, and find out the crucial target genes.By employing EMSA, transcriptional fusion and sRNA-mRNA interaction system, the mechanisms between CsrC and each crucial target genes will be explored. To build an interaction model between CsrC and Hfq, CsrA and ald, SPR and EMSA analysis will be employed to determine their interaction kinetics. This project aims to clarify the regulation of carbon and nitrogen metabolic flux directed by the new type of sRNA in V. alginolyticus, and thus expand the knowledge about the molecular mechanism of sRNA-mediated gene regulation,which may assist to further understand the pathology and epidemiology of the disease caused by vibrio species.

调节性非编码小RNA（sRNA）介导的基因表达调控是细菌生命活动重要的调节机制之一。前期研究中我们首次发现溶藻弧菌一个双机制sRNA CsrC，它既能在RNA分子伴侣Hfq协助下，通过不完全配对与丙氨酸脱氢酶基因（ald）结合，也能以蛋白隔离子形式与糖代谢相关泛调控因子CsrA结合，因此可能同时调节细胞碳氮代谢。在此基础上，本项目拟通过代谢组和转录组分析等鉴定CsrC调控的主要代谢途径和关键节点基因；通过sRNA-mRNA作用检测、多水平基因表达分析等研究CsrC调控这些基因的方式；通过表面等离子共振(SPR)、凝胶迁移(EMSA)等揭示CsrC与Hfq,CsrA和ald的多分子作用机制；从而发现CsrC调控溶藻弧菌碳氮代谢的机理，阐明这类新型sRNA与目标基因相互作用的分子基础。这将不仅有助于揭示sRNA在溶藻弧菌基础生命活动中的作用，也将拓展人们对sRNA作用机制的认识。

调节性非编码小RNA（sRNA）介导的基因表达调控是细菌生命活动重要的调节机制之一。前期研究中我们首次发现一个双机制sRNA CsrC（后统一命名为CsrB4），参与溶藻弧菌丙氨酸代谢调控。但是作为碳储存调节系统（Csr）的一部分，它和该系统其它成分在溶藻弧菌中的生理功能，以及调控基因表达的分子机制没有研究报道。本项目构建了溶藻弧菌CsrBs-CsrA系统的缺失和回补株，分析了它们对丙氨酸和其它氨基酸代谢的影响；开展了转录组、蛋白组和代谢组学分析，鉴定了主要差异表达基因、蛋白和关联代谢通路；研究了CsrB4和其它CsrB共同调控丝氨酸转运蛋白基因sdaC表达的新机制；分析了它们调控ald表达的调控网络，并深入开展了CsrBs、CsrA与目标mRNA的多分子作用模式和机制。经过研究，揭示了CsrB4以及其它三个CsrB类sRNA和CsrA共同作用，调控包括糖酵解、丙酮酸循环、氨基酸脱氨和氨基酸的从头合成等核心代谢，三型分泌系统和六型分泌系统等致病基因表达，群体感应和DNA修复等与生长、代谢以及致病等关键生命过程。首次解析了转录后调控在溶藻弧菌ald和sdaC表达调控的复杂机制。发现了它们通过经典的CsrA抑制和CsrBs解抑制调控ald转录激活因子Lrp的翻译，间接影响ald的转录；同时还通过lrp 反义RNA机制（antisense RNA）、Hfq-GcvB小RNA互补配对机制，以及CsrA抑制和CsrBs解抑制等多种转录后调控手段，直接控制ald mRNA的稳定性和翻译效率，这些调控机制共同作用下保证细胞内丙氨酸、丙酮酸以及NAD+/NADH处于平衡状态。研究还首次发现了sdaC起始密码子上游的翻译增强子序列，揭示了CsrBs通过互补配对方式抑制翻译复合物中S1蛋白与增强子结合，从而直接抑制sdaC翻译过程的新机制。通过多种手段，开展了CsrBs、Hfq、CsrA和典型目标基因的互作机制研究。这些结果显示了弧菌中碳存储调节系统的重要性与独特性，进一步深入研究将可能揭示弧菌高效代谢、快速生长的驱动机制，为开发弧菌病高效绿色防控技术提供理论基础和分子靶标。