sRNA srvg23535调控exsE影响溶藻弧菌毒力的分子机制

Bacterial small RNA (sRNA) mediated gene regulation plays an important role in the modulation of bacterial life activities. Our previous study has identified a novel sRNA srvg23535 in Vibrio alginolyticus. The deletion of srvg23535 significantly increased its virulence to zebrafish, and down-regulated the expression of a type III secretion system (T3SS) regulator gene exsE, indicating srvg23535 may negatively regulate the virulence of V. alginolyticus by promoting the expression of exsE and thus influencing the activity of T3SS. To test this hypothesis, the means of EMSA, sRNA-mRNA interaction system, transcriptional fusion, translation fusion and rifampicin block experiment will be employed to elucidate interaction mechinism between srvg23535 and exsE. By employing qRT-PCR, cell adhesion, cell invasion and zebrafish infection experiments, the effects of srvg23535 and exsE deletion on T3SS-related gene expression and host virulence will be explored. This project aims to clarify the virulence regulation mechanism by the new sRNA srvg23535 in V. alginolyticus, which may help to further deepen the pathogenic mechanism research of sRNAs in V. alginolyticus and even other pathogenic vibrio with providing new targets for vibriosis prevention and control.

细菌小RNA（sRNA）介导的基因表达调控是细菌生命活动的重要调节手段。前期研究我们首次鉴定得到溶藻弧菌sRNA srvg23535，并发现其缺失后对斑马鱼的毒力增强，且三型分泌系统（T3SS）调控子编码基因exsE的表达显著下降。因此，推测srvg23535通过促进exsE表达，影响T3SS活性，进而负调控溶藻弧菌的毒力。在此基础上，本项目拟结合sRNA-mRNA双质粒作用系统、EMSA、转录融合、翻译融合以及利福平阻滞等手段，明确srvg23535与exsE的相互作用机制；进一步通过qRT-PCR、细胞黏附、细胞侵袭和鱼体感染实验，确定srvg23535调控exsE影响溶藻弧菌T3SS的表达及对宿主的毒性，从而阐明srvg23535调控exsE影响溶藻弧菌毒力的分子机制。这将进一步深化sRNAs对溶藻弧菌甚至海洋病原弧菌致病的作用机制的研究，也为海洋弧菌病害防控技术的研发提供新的靶标。

细菌小RNA（sRNA）介导的基因表达调控是细菌生命活动的重要调节手段。前期研究我们首次鉴定得到溶藻弧菌sRNA srvg23535，并发现其可能调控三型分泌系统（T3SS）调控子编码基因exsE的表达，而影响T3SS活性，进而调控溶藻弧菌的毒力。本项目在前期研究基础上，结合sRNA-mRNA双质粒作用系统、EMSA、翻译融合、WesternBlot分析、基因敲除、RT-PCR等手段，明确溶藻弧菌中sRNA srvg23535以及伴侣蛋白Hfq调控exsE基因影响细菌毒力的作用机理。研究发现，exsE在srvg23535和hfq缺失后，翻译水均提高；此外，exsE在hfq缺失后转录水平在对数早期显著提高；同时EMSA实验表明，srvg23535和exsE均与Hfq蛋白结合，因此srvg23535在hfq协助下负调控exsE的翻译。进一步斑马鱼毒力研究发现，srvg23535缺失后，溶藻弧菌毒力略微下降， hfq缺失后，细菌毒力显著下降至0%，而exsE缺失后，细菌毒力显著上升至75.5%。因此，srvg23535在Hfq辅助下，抑制exsE的翻译，从而促进溶藻弧菌毒力。此外，利用比较转录组，我们获得了104个主要涉及鞭毛合成、趋化运动、生物膜形成、以及细菌分泌系统的基因为srvg23535的潜在靶标基因，并对其中的cbpD进行功能研究，发现cbpD可能通过正调控溶藻弧菌的运动能力和胞外蛋白酶分泌活性，而促进溶藻弧菌的毒力。此研究丰富了溶藻弧菌sRNAs的调控作用研究，也为海洋弧菌病害的防控技术的研发提供新的靶标，旨在为保障水产品的健康提供参考。