胆汁酸介导的霍乱弧菌毒素基因表达的分子调控机制研究

Vibrio cholerae is the causative agent of the diarrheal disease cholera. For V. cholerae to successfully infect a host, it must readily alter its phenotypic properties to allow for positive adaptations to the host environment. However, which host factors V. cholerae sense to and how V. cholerae initiate transcriptional regulatory cascades to induce virulence genes in the small intestines arelargely unknown. Using a newly developed ex vivo tissue model, we found that taurocholic acid, a bile acid present in mammalian small intestines, induces key V. choleraevirulence regulatory pathways. Although bile salts activated virulence genes expression by affecting the transmembrane transcription factor TcpP, yet, the exact mechanism is unclear. Whether bile salts directly interact with TcpP protein, or bile salts enhance TcpP activity by interacting with other regultory factors would be further studied in this application. We will apply in vitro pull-down assay, luminescence assay and other biochemical and genetic methods to elucidate the mechanism how bile salts enhance TcoP activity so as to activate virulence genes expression in V.cholerae. These studies will thus allow us to gain a fuller understanding of the bacteria-host interactions that have allowed V. choleraeto become such a successful human pathogen. On the other hand, we will screen for those competitive inhibitors for the taurocholate acid, which can interfere the activation of of dimerization of TcpP by taurocholate acid. These inhibitors will be able to attenuate the induction effect of virulence genes of V.cholerae by the bile salt molecules in the small intestine, so they would be the very good candidates for developing the non-antibiotic drugs for the treatement of diarrheal in the future.

霍乱弧菌是人类重要的肠道病原菌，胆汁酸可通过增强毒素基因调控蛋白TcpP形成二聚体，从而诱导霍乱弧菌毒素基因的表达。但是胆汁酸如何增强TcpP二聚体形成的分子机制尚不清楚，而且肠道中除了胆汁酸分子之外，霍乱弧菌毒素基因的表达是否受其它信号因子的调控，也不明晰。因此，本项目将通过Octet分子互作、等温滴定量热和体外共沉淀技术，从研究胆汁酸分子与膜蛋白TcpP的相互作用入手，揭示胆汁酸分子对细胞膜蛋白功能与结构的影响，进而通过RNA-Seq等手段构建胆汁酸影响霍乱弧菌毒素基因表达和群体感应信号的分子调控网络，阐明霍乱弧菌中毒素基因的分子调控机制。同时，通过文库构建、同位素标记等方法筛选影响毒素基因表达的胆汁酸分子竞争性抑制剂，为筛选干预肠道细菌毒素性腹泻疾病的非抗生素类靶向药物提供重要的理论依据。

霍乱弧菌是引起人类肠道急性腹泻的病原菌，其生活周期包括体外的水生环境和人类肠道环境。研究表明：环境中温度、氧气浓度、胆汁液、pH 值以及某些营养元素的浓度等，对霍乱毒素基因的表达有不同的影响，而尤其是霍乱弧菌毒素基因的表达受到严谨调控。我们前期的研究结果发现，肠道中的胆汁酸分子可以在体外特异性的诱导霍乱弧菌毒力基因的表达，然而其具体的分子机制还不是很清楚，本项目的研究目的是阐明胆汁酸分子诱导霍乱弧菌毒力基因表达的分子机制。通过4年的研究我们发现胆汁酸分子是通过抑制霍乱弧菌周质空间中的DsbA蛋白的再氧化活性，从而使得跨膜蛋白TcpP周质空间结构域两个半胱氨酸残基形成分子内二硫键的速度减慢，进而使得TcpP形成更多的分子间的二硫键。形成分子间二硫键的TcpP蛋白会更多的以二聚体的形式存在，而二聚体形式的TcpP蛋白具有更强的激活下游基因表达的活性。因此，当霍乱弧菌进入人体小肠后，存在于小肠中的胆汁酸分子进入霍乱弧菌周质空间后，与二硫键氧还蛋白DsbA结合并抑制其被DsbB蛋白氧化的活性。TcpP是DsbA蛋白的催化底物，结合了胆汁酸分子的DsbA蛋白氧化TcpP的效率降低，从而使得TcpP周质空间的两个半胱氨酸残基被氧化的速度降低，而处于氧化态和还原态的半胱氨酸残基通过二硫键氧还转换，形成更多的分子间的二硫键，进而使得TcpP形成更多的二聚体，从而使得霍乱弧菌进入小肠后迅速表达与定殖相关的毒力因子。胆汁酸分子除了通过DsbA影响TcpP分子间二硫键的形成以外，我们还发现胆汁酸分子也有可能通过影响TcpP跨膜结构域的结构，从而使得TcpP形成更多的二聚体。通过构建TcpP跨膜结构域的定点突变子并对其蛋白功能进行分析发现，不管是否有胆汁酸分子的存在，TcpP L152A都能形成二聚体形式，并且组成型的激活toxT基因的表达，突变株TcpP L152A在乳鼠定殖模型中表现出更强的定殖能力，然而胆汁酸分子究竟如何通过影响TcpP跨膜结构域的结构从而使得TcpP形成更多二聚体，这个分子机制还有待进一步研究。