霍乱弧菌MSHA菌毛基因簇表达调控的分子机制研究

Vibrio cholerae is the causative agent of the diarrheal disease cholera. V. cholerae forms biofilms during the aquatic and intestinal phases of its life cycle, and biofilm plays an important role in both of these two phases for V.cholerae to survive. The mannose-sensitive hemagglutinin (MSHA) pili which is a member of the type IV pilus (TFP) family is critical for V.cholerae biofilm formation, especially during the surface attachment process. However, the regulatory mechanism of MSHA operon in V.cholerae is largely unknown. In the previous study, we found that the disulfide bond formation protein DsbA and DsbC is indispensible for MSHA operon expression. So in this proposal, we are going to further investigate the mechanism of how MSHA operon is activated in V.cholerae. What environmental signals and what regulatory factors are involved in MSHA gene activation? How MSHA pili works during biofilim maturation and dispersal? What is the structure of MshA? How MshA assembles together to form MSHA pili? We will apply in vitro pull-down assay, luminescence assay and other biochemical and genetic methods to find out the answers for all these questions, so as to elucidate the mechanism of MSHA operon expression regulation which will definitely help us to gain a fuller understanding of the process of biofilm formation that have allowed V. cholerae to become such a successful human pathogen.

霍乱弧菌是人类重要的肠道病原菌，生物被膜在霍乱弧菌的生活和侵染周期中发挥着重要的作用。霍乱弧菌生物被膜的形成依赖于MSHA菌毛与表面的相互作用，缺失MSHA菌毛的霍乱弧菌不能形成成熟的生物被膜。然而对于霍乱弧菌MSHA基因的表达调控机制尚不清楚。本项目将以研究霍乱弧菌二硫键氧还蛋白对MSHA基因表达的影响为切入点，利用体外小鼠肠道模型和遗传筛选，确定诱导MSHA基因簇表达的信号因子和调控因子，揭示霍乱弧菌MSHA基因表达信号调控通路；通过基因表达与功能分析，确定MSHA菌毛在霍乱弧菌生物被膜成熟与解离阶段的作用，阐明MSHA菌毛在霍乱弧菌生物被膜形成的各个阶段中的作用机制；再利用生物化学和结构生物学的方法，对MshA蛋白的结构进行解析，进一步阐明MshA蛋白的生理功能。本研究将为阐明霍乱弧菌MSHA菌毛基因表达调控的分子机制及其在生物被膜形成过程中的作用提供重要的理论依据。

霍乱弧菌是人类重要的肠道病原菌，生物被膜在霍乱弧菌的生活周期和侵染周期中发挥着重要的作用。霍乱弧菌生物被膜的形成依赖于MSHA菌毛与表面的相互作用，缺失MSHA菌毛的霍乱弧菌不能形成成熟的生物被膜。然而对于霍乱弧菌MSHA基因的表达调控机制尚不清楚。本研究通过构建霍乱弧菌基因组文库，对筛选2.5万株克隆，最终筛选得到两个转录因子，VC1371和VcrfaH对MshH启动子具有正调控作用。这两个调控因子通过作用于mshH启动子，激活MSHA 基因簇的表达，进而对于霍乱弧菌生物被膜的形成产生重要影响。此外，我们利用乳鼠以及成年鼠肠道定殖模型探究霍乱弧菌定殖的分子机制，发现VC1371和VcrfaH对于霍乱弧菌在肠道中的定殖具有关键作用。通过进一步探究MSHA影响霍乱弧菌在成年鼠肠道中定殖的分子机制，我们发现位于MSHA基因簇的第一个基因mshH，其在霍乱弧菌进行成年鼠肠道竞争定殖的过程中具有关键的作用，且MshH发挥作用并不依赖于MSHA菌毛的功能，而是通过调节csrB，csrC以及csrD的RNA含量，精密调控全局调控因子CsrA蛋白的活性，从而实现帮助霍乱弧菌在成年鼠肠道中更好的定殖的功能，另外，我们还发现MshH具有帮助CsrC稳定的功能，这是我们首次报道MshH同源蛋白能够帮助sRNA稳定而非加速其降解，且该过程是MshH通过调控CsrA的活性而实现的。然而，MshH为什么能够加速降解被CsrA结合的CsrB和CsrD, 却不会对被CsrA结合的CsrC产生降解作用，这个分子机制还有待进一步研究。另外，我们以探究TcpP胞内蛋白结构域的功能为切入点，以乳鼠以及成年鼠肠道为模型，发现TcpP蛋白可以利用胞内四个半胱氨酸转换其调控毒力基因以及MSHA基因簇表达的能力，帮助霍乱弧菌在不同的肠道环境中生存。通过本项目的研究，揭示霍乱弧菌MSHA基因表达信号调控通路，确定MSHA菌毛在霍乱弧菌生物被膜成熟与解离阶段的作用，阐明MSHA菌毛在霍乱弧菌生物被膜形成的各个阶段中的作用机制。本研究将为阐明霍乱弧菌MSHA 菌毛基因表达调控的分子机制及其在生物被膜形成过程中的作用提供重要的理论依据。