从影响内质网-线粒体交互作用的角度探讨抗凋亡蛋白Bcl-2在卵巢癌耐药机制中的作用

Tumor cells express high level antiapoptotic protein Bcl-2, which cause tumor cells escape from the death induced by chemotherapeutic drugs and gain drug resistance. We previously found that the small molecule chemical drugs (ABT737, S1) targeted Bcl-2 could induce endoplasmic reticulum stress (ER stress) and mitochondrial pathway apoptosis, which deteriorate drug resistance in ovarian cancer cells. Recently studies showed that ER stress not only produced apoptotic signal, but also could enhance signaling cascade, and the interaction between the mitochondria and ER determined cell fate. So we presume that antiapoptotic protein Bcl-2 could take part in cell drug resistance through having effects on mitochondrion-ER interaction. In this study, Bcl-2 inhibitors are used and combination with molecular cloning technology to change the expression and subcellular location of Bcl-2, to study the effect of calcium ion transfer from ER to mitochondrion regulated by the mitochondrion-ER structural and functional network on the cisplatin resistant mechanism of ovarian cancer in vitro and in vivo, and investigate deeply the influence of Bcl-2 on this procedure. To investigate the effect of the antiapoptotic protein Bcl-2 on the drug resistant mechanism of ovarian cancer from the point of view that it affects ER-mitochondrion interaction, and study deeply the classic tumor associated protein Bcl-2 involves in the molecular mechanism of tumor drug resistance. So as to provide the theoretical and experimental basis for the development of new methods in cancer treatment.

肿瘤细胞高表达抗凋亡蛋白Bcl-2能导致细胞逃避死亡对化疗药物产生耐受。我们前期工作显示以Bcl-2为靶点小分子化合物（ABT737,S1）可诱导内质网应激反应、线粒体途径凋亡，具有逆转卵巢癌细胞耐药作用。最近研究认为内质网既能产生诱导凋亡信号，又可能是信号级联放大者，线粒体与内质网等交互作用决定细胞命运。因此,我们推测抗凋亡蛋白Bcl-2可能通过影响线粒体与内质网间交互作用参与肿瘤细胞耐药机制。本课题利用Bcl-2抑制剂，结合分子克隆技术改变Bcl-2表达和亚细胞定位，通过体内外实验研究线粒体-内质网结构和功能性网络调控的从内质网到线粒体Ca2+转运在人卵巢癌顺铂耐药机制中的作用，并深入探讨Bcl-2对其影响。本研究从内质网-线粒体交互作用的角度探讨抗凋亡蛋白Bcl-2在卵巢癌耐药机制中作用，深入研究这一经典肿瘤相关蛋白参与肿瘤耐药分子机制，以期为开发新的肿瘤治疗方法提供理论和实验基础。

已有研究发现Bcl-2家族蛋白不仅在调节内质网应激诱导的细胞凋亡起始中起作用，且在维持Ca2+持续性稳态过程中也发挥重要作用；内质网和线粒体间存在结构和功能上紧密联系，而Bcl-2家族蛋白对线粒体-内质网之间的信息传递产生影响。本研究首先研究了从内质网到线粒体的Ca2+转运在肿瘤耐药中的作用；其次研究Bcl-2蛋白通过调控线粒体和内质网交互作用网络在肿瘤耐药机制中发挥重要作用的机制；再次体内实验研究采用SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞分别建立裸鼠荷瘤模型，检测顺铂作用下肿瘤生长，肿瘤组织微观变化，内质网应激、线粒体动力学和细胞凋亡等相关蛋白的表达；转染Bcl-2表达载体到SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞，建立稳定表达细胞系，建立裸鼠荷瘤模型；顺铂单独或联合Bcl-2抑制剂作用下，观察肿瘤生长，电镜观察肿瘤组织微观的变化；检测内质网应激、线粒体动力学和细胞凋亡等相关蛋白的表达。我们研究发现，内质网应激耐受通过稳定内质网和线粒体稳态参与卵巢癌耐药；抑制JNK促进了BH3模拟物S1诱导的人卵巢癌耐药细胞凋亡；抑制Bcl-2通过调节内质网-线粒体钙信号传导，逆转了人卵巢癌顺铂耐药；钙离子升高诱导氧化应激失调影响人卵巢癌顺铂耐药性；Bcl-2过表达通过降低内质网-线粒体钙信号减轻了顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞的毒性作用；Bcl-2抑制剂ABT737通过调节DRP1依赖的线粒体分裂诱导了人卵巢癌线粒体途径的凋亡和线粒体自噬；细胞内钙离子增加通过调节iNOS的表达降低人卵巢癌细胞顺铂耐药性；BMH-21诱导p53依赖性核仁应激诱导卵巢癌细胞凋亡；杨梅素通过内质网应激和DNA双链断裂诱导人卵巢癌细胞凋亡；2-DG 通过增加内质网应激降低ATP在酸性囊泡的贮存增加人卵巢癌细胞对顺铂敏感性。以上研究结果，确定了Bcl-2 抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡作用的内质网关键信号通路，阐明了抗凋亡蛋白Bcl-2通过内质网-线粒体交互作用调控细胞死亡信号网络的作用机制，为卵巢癌耐药机制提供了新的线索，为开发逆转卵巢癌化疗耐药的药物提供了实验依据和新的思路。