67-kDa层粘连蛋白受体及其调控通路在贝类细胞生长分化中的功能解析

层粘连蛋白受体（laminin receptor, LR）及其调控通路在细胞的黏附、分化和生长中具有重要调控功能，并进而维持和促进器官组织的发育和形成。本研究在先期获得的文蛤67-kDa LR基因（MmeLR-67）的基础上，通过RT- PCR、Western blot等技术分析MmeLR-67在文蛤不同发育阶段和不同组织的时空表达特征；通过原代培养细胞的RNAi和转基因技术，分析MmeLR-67及其调控通路中钙调蛋白、钙调蛋白激酶等关键基因的表达变化；结合免疫组化、流式细胞仪等技术，在不同水平上检测干扰和过表达效果，分析MmeLR-67及其调控通路对细胞生长分化的影响。预期研究结果对深入认识贝类生长发育过程中细胞分化和器官形成的分子调控机制具有重要意义，同时，贝类细胞培养、RNAi和转基因技术的建立将为海洋无脊椎动物功能基因的分析验证和功能解析提供新的研究平台。

层粘连蛋白受体（laminin receptor, LR）是存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，介导细胞与细胞间以及细胞与细胞外基质间的相互作用。LR通过与其配体层粘连蛋白（laminin, LN）的结合，构架的细胞同基膜间的信号传递通路，对胚胎早期发育、重要组织器官的形成以及维持生物体正常新陈代谢等生理活动具有重要作用。. 本项目以典型的经济双壳贝类文蛤为实验对象，克隆获得了文蛤67 kD LR基因（MmeLR）的全长cDNA序列，并分析了该基因的时空表达情况，提示其参与了文蛤的生长和发育调控。在此基础上，进一步在细胞水平、幼体发育阶段和成体阶段研究了MmeLR及其调控通路对文蛤生长发育的调控机制，主要研究结果如下：. 通过RACE从文蛤中获得了MmeLR的全长cDNA序列,将MmeLR基因进行原核重组表达，制备了多克隆抗体；利用realtime PCR 和western blot对MmeLR的mRNA和蛋白的组织分布特征进行了研究；利用far-western技术，验证了MmeLR及其配体层粘连蛋白（LN）间存在特异性相互作用。 . 通过优化培养条件，实现了稳定培养文蛤血细胞、外套膜和肝胰脏等组织的原代细胞达2-3周，并使之维持较高活力，为在细胞水平上进行基因功能验证等打下了基础。在文蛤原代培养细胞中，以matrigel（主要成分为LN）包被培养皿培养的文蛤外套膜细胞，在12h和24h时MmeLR的mRNA和蛋白表达量明显低于对照组；同时，凋亡指示基因bcl-2和P53的mRNA表达量在试验组和对照组也有显著差异，上述结果提示了MmeLR在细胞凋亡中的作用。. 制备了MmeLR的双链RNA（dsRNA）和siRNA（small interference RNA）并在文蛤原代细胞中进行了干扰方法研究，沉默效率可以达到60%；构建了两种LR过表达质粒，在HeLa细胞系和SF9细胞系中进行了转染实验，可以稳定检测到EGFP阳性信号。在文蛤原代细胞中，对几种质粒进行了转移条件的探索，包括电穿孔法、脂质体转染法等。. 研究了文蛤幼虫发育过程中MmeLR的功能，对其在文蛤幼虫不同发育阶段的表达谱进行了研究，使用免疫荧光技术分析了MmeLR在文蛤幼虫的时空分布。使用MmeLR的siRNA对文蛤幼虫进行了干扰实验，并对其下游调控通路进行了初步分析。