茶氨酸合成相关酶的功能验证及其对茶氨酸代谢调控的分子机制

根据本课题组由文库筛选得到的EST序列contig47和contig48，克隆全长cDNA序列TSct47和TSct48；并与茶氨酸合成酶基因TS1、TS2和谷氨酰胺合成酶基因GS3一起分别转化大肠杆菌，亲和层析纯化基因转化蛋白；选择不同底物组合进行酶促反应，鉴定酶促反应产物并进行酶学性质研究，对上述基因序列进行功能验证。同时，将上述茶氨酸代谢相关酶基因分别转化拟南芥，通过Northern和Western杂交分别测定上述基因在转录和翻译水平上的表达差异；并以绿色荧光蛋白（GFP）为标记，对TS和GS酶进行细胞定位。尝试构建茶氨酸合成酶RNAi反义表达载体，以IL-60-BS病毒为介导并转化茶籽苗，研究转基因茶苗体内茶氨酸合成情况及其对茶氨酸代谢的调控机理。本项目研究将为揭示茶树体内茶氨酸代谢的复杂生理生化过程，以及采用酶工程技术或转基因工程菌发酵生产高纯度茶氨酸，都将具有十分重要的意义。

茶氨酸主要存在于山茶科(Theacea)植物中，为茶树中特有的富有生物活性作用的次生代谢产物，对人体具有重要的保健功能和药理作用。针对其研究发现，茶氨酸合成酶（Theanine synthetase）与谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase）的核酸序列高度同源，但是其合成产物茶氨酸与谷氨酸在茶树体内的积累及调控却截然不同。本项目中，我们通过对构建的茶苗嫩根EST数据库和茶树多器官混合转录组数据库进行筛选比对，选取一批与茶树氮代谢有关的基因进行全长克隆、原核表达和产物的功能鉴定，并选取茶氨酸合成酶及谷氨酰胺合成酶基因进行对比研究。针对这些基因序列，我们进行了正反向的基因功能验证工作（原核表达、真核表达、QPCR研究、酶活性检测以及遗传转化体系的构建），同时针对TS与GS表达与调控的机制进行了不同处理条件下的研究，包括遮阴与外源一氧化氮诱导调控。结果从核酸水平和蛋白水平揭示了茶氨酸合成酶的表达的时空特异性以及外源诱导调节的响应机制。这对于研究调控茶氨酸在茶树中的生物合成，为茶树基因工程育种，以及生产上指导合理合宜的茶鲜叶采摘均具有重要的理论与实践意义。