2-BFI抗脑缺血兴奋毒性损伤的NMDAR亚基NR2A/NR2B选择作用机制研究

Ischemic stroke is a common cause of death and disability, The NMDA receptor mediated excitotoxicity is considered as main factor in the ischemia induced neuronal death. Recent studies have proved that NMDAR containing NR2A subunit is mainly located in the synapse mediates cell survival and the NMDAR containing NR2B subunit is mainly located in the extrasynapse mediates cell death. Imidazoline compound 2-BFI is a high affinity Imidazoline I2 receptor of exogenous ligand，but in our previous study we first found that 2-BFI is a NMDAR antagonist which inhibited extracellular Ca2+ influx in a manner similar to that of memantine, a Classic drugs for therapeutic inhibition NMDAR-induced excitotoxicity. Whether the inhibition of 2BFI on NMDAR has the selectivity for NR2A/NR2B subunit remain unclear. In this project, we will use the whole cell patch clamp to investigate the effect of 2-BFI on the N2A-NMDAR activated currents and the N2B-NMDAR activated currents , We will use OGD model and MCAO model to investigate the effect of 2-BFI on the expression of prosurvival factors mediated by N2A-NMDAR and the Pro death factor mediated by N2B-NMDAR. These research will provide a theoretical basis for the clinical transformation of 2-BFI.

缺血性卒中是严重影响人类生命健康的疾病, NMDAR介导的兴奋性毒性是神经元缺血损伤的关键环节，近年来的研究证明包含NR2A亚基的NMDAR主要在突触内介导细胞存活，包含NR2B亚基的NMDAR主要在突触外介导细胞死亡。咪唑啉化合物2-BFI是一种亲和力极高的咪唑啉I2受体的外源性配体，但是，我们在研究中首次发现2-BFI也是一种NMDAR拮抗剂，其抑制胞外Ca2+内流的方式与经典的抑制NMDA诱导的兴奋性毒性药物美金刚非常相似。 然而，2-BFI对NMDAR的抑制作用是否具有NMDAR亚基NR2A/NR2B的选择性还不清楚，本课题拟采用全细胞膜片钳技术观察2-BFI对N2A- NMDAR激活电流和N2B-NMDAR激活电流的影响，并通过OGD模型和MCAO模型观察2-BFI对N2A-NMDAR介导的促存活因子和N2B-NMDAR介导的促死亡因子的表达，为2-BFI 的临床转化提供理论依据

NMDAR介导的兴奋毒性是神经元缺血损伤的关键环节，NMDAR拮抗剂可有效减轻脑缺血症状。近年来的研究证明包含NR2A亚基的NMDAR主要在突触内介导细胞存活，包含NR2B亚基的NMDAR主要在突触外介导细胞死亡，选择性抑制位于突触外的NR2B-NMDAR，这对于开发新型NMDAR拮抗剂来抵抗缺血介导的兴奋性毒性具有非常重要的意义。咪唑啉化合物2-BFI是一种亲和力极高的咪唑啉I2受体的外源性配体，我们在以往的研究中发现2-BFI也是一种NMDAR拮抗剂，2-BFI能够可逆地抑制NMDAR介导的Ca2+内流，可以减轻谷氨酸介导的兴奋毒性，但是，2-BFI对NMDAR的抑制作用是否具有NMDAR亚基NR2A/NR2B的选择性还不清楚。.本课题采用全细胞膜片钳技术观察2-BFI对N2A- NMDAR和N2B-NMDAR激活电流的影响，结果发现：（1）相同浓度的2-BFI（100μM）对加入Ifenprodil 阻断电流后剩余成分的NMDAR电流抑制作用明显弱于NVP-AAM077阻断电流后剩余成分；（2）2-BFI对加入Ifenprodil 阻断电流后剩余成分的抑制调节作用浓度-效应曲线的IC50浓度为238.6 µM [95%可信区间：213.6 -266.8 µM]显著高于NVP-AAM077阻断电流后剩余成分浓度-效应曲线的IC50浓度18.47 µM[95%可信区间：15.93 -21.42µM]；（3）2-BFI 对转染 NR1/NR2B 的 HEK293 细胞的 INR1/NR2B电流抑制调节作用明显强于转染 NR1/NR2A 的HEK293 细胞的 INR1/NR2A 电流。2-BFI治疗短暂性大脑中脉栓塞模型（tMCAO）的实验发现2-BFI 主要通过作用于 NR2B 亚基，抑制 NR2B 亚基 1303 位 Ser 的磷酸化，调节 NR2B 亚基下游通路蛋白的表达发挥对缺血性卒中的神经保护作用；2-BFI对Grin2a基因敲出小鼠的MCAO模型有神经保护作用，这些实验数据提示2-BFI抗缺血兴奋毒性主要是通过作用于NR2B-NMDAR亚基而起作用的，这些发现为2-BFI 治疗缺血性卒中向临床转化奠定了更加坚实的理论基础。