CUL5 在参与蛋白尿时肾小球上皮细胞内质网应激的分子机制

蛋白尿是各类肾脏病重要临床症状，也是慢性肾功能衰竭的独立危险因素。本研究小组前期研究表明，CUL5在人及小鼠的足细胞有显著表达，其表达敲低后斑马鱼出现蛋白尿、水肿及肾小球结构变化，说明 CUL5 对保持足细胞功能完整性有重要作用。真核细胞的蛋白是在内质网中合成，当在各种因素作用下新生肽链的修饰折叠与组装受到干扰，将产生内质网应激。本研究小组工作还证实，蛋白尿病人存在CUL5的表达变化，而且有肾病综合征病人出现了CUL5编码上A762G的突变；在肾病综合征患者的足细胞中Cullin-5的表达是显著下降的，并且存在内质网应激。因此，本研究采用培养的小鼠足细胞株 MPC5，诱导CUL5 定点突变等方法，了解内质网应激情况；分析突变后CUL5在细胞浆中的表达；足细胞形态及功能变化；细胞凋亡情况。从而阐明 CUL5 在参与蛋白尿时肾小球上皮细胞内质网应激的分子机制。为蛋白尿病人的治疗提供理论依据。

蛋白尿是各类肾脏病重要的临床症状，也是慢性肾功能衰竭的独立危险因素。我们的研究表明，CUL5在人及小鼠的肾小球细胞有显著表达，其表达敲低后斑马鱼出现蛋白尿、肾性水肿及肾小球结构等变化，说明 CUL5 对保持肾小球上皮细胞功能完整性可能具有非常重要的作用。真核细胞的蛋白是在内质网（ER）中合成，当在各种因素作用下新生肽链的修饰折叠与组装受到干扰，产生内质网应激。 为此我们进行了相关的研究。.首先对小鼠足细胞株MPC5培养，经33℃细胞增殖和 37℃细胞分化。我们用Western Blot检测到MPC5中Cullin-5的表达。同时，我们又用免疫荧光方法证实了无论未分化或分化的MPC5均高表达 Cullin-5。我们分别用葡萄糖、肿瘤坏死因子TNF-α、嘌呤霉素及TM诱导内质网应激。经MTT筛选TM作用浓度及时间。Western blot结果显示0.5umol/L和5umol/L的TM均能使MPC5表达CUL5、Nephrin和podocin水平降低，表达磷酸化PERK、CHOP、内质网伴侣分子GPR78（即Bip）水平增加。Real-time PCR的结果和Western blot结果一致。表达细胞骨架相关蛋白Synaptopodin、整合素α3β1-Intergrin mRNA水平有明显变化。免疫荧光结果显示5umol/L的TM作用24小时后MPC5细胞皱缩，核变小，Nephrin、Synaptopodin在胞浆周围聚集。用HQH预处理6小时，然后再用不同浓度TM诱导MPC5损伤模型，发现，HQH持续作用时间越长，对TM诱导的MPC5损伤的保护作用越明显，。仅预处理6h条件下，TM对MPC5细胞的损伤较明显，而HQH预处理6h并持续作用30h条件下，同时用TM诱导MPC5所引起的损伤较轻。我们还发现，TM诱导MPC5损伤后Cul5及Bip表达水平的降低作用在MPC5用HQH预处理6小时情况下有一定程度的改善。另外，我们还检测了损伤模型也HQH干预下自噬相关蛋白LC3及p62的变化。人Cul 5基因A762G突变，32位氨基酸是精氨酸（R），小鼠Cul 5基因762位为G，32位氨基酸是谷氨酰胺（Q）。我们通过CRISPR/Cas9 方法敲除肾小球足细胞MPC5中的Cul 5基因。用pCas9/gRNA1载体敲除肾小球足细胞MPC5中的Cullin-5基因。但MPC5