EspB通过介导EsxA/EsxB的分泌影响结核分枝杆菌致病性的机制研究

With the emergence of drug resistant Mycobacterium tuberculsis (MTB), tuberculosis remains a global threat to public health. MTB secretes some important virulence proteins including EspB, EsxA/B by the ESX-1 system to keep the virulence and pathogenicity. The secretion of EsxA/B depends on EspB, but the transport mechanism of EsxA/B is not clear especially from periplasmic space to outer membrane. Our studies have showed that EccB1 is a hexmeric ATPase located in the periplasmic space, which involves in the transmembrane channel and provides energy for the transport process. Our previous studies show that EspB interact with EccB1 and EsxA/B respectively, and EspB is likely to a channel protein analyzed by its heptameric structure, which reminder us that EspB affect the virulence and pathogenicity of MTB by mediating the EsxA/B transport from the periplasmic space to the outer membrane. This study will state the molecular machnism of EspB transporting the EsxA/B based on the detecting of the heptameric structure and function of EspB. And then, the virulence of Mycobacterium tuberculosis will be detected by infecting the macrophages with the important mutant proteins and strains of EspB, respectively. This study will not only discover the machnism of EspB affecting virulence and pathogenicity of MTB and also open up a new avenue of development of anti-tuberculosis drugs.

随着结核菌耐药菌株的出现，结核病依然是最严重的世界卫生问题之一。结核菌通过ESX-1系统分泌重要的毒力蛋白以维持自身的毒力和致病性，其中包括EspB，EsxA/B。EspB是EsxA/B分泌所必需的，但EsxA/B的分泌机制尤其是从周质空间到外膜的转运过程还不清楚。我们首次发现EccB1是一个定位于周质空间的六聚体ATPase，既参与了周质空间转运通道的形成，又为转运过程提供能量。EspB能够跟EccB1和EsxA/B底物发生相互作用，再结合我们初步解析的EspB七聚体结构信息，EspB极有可能通过介导EsxA/B从周质空间到外膜的转运影响结核菌的毒力和致病性。本研究拟从EspB七聚体结构和功能入手，揭示EspB在EsxA/B转运过程中的分子机制，并通过检测EspB突变体蛋白和菌株对巨噬细胞产生的毒力变化，阐释EspB影响结核菌毒力和致病性的机制，为抗结核药物的研发提供新思路。

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的全球致死率最高的单一传染性疾病。随着艾滋病共感染以及耐多药结核菌株的出现，对结核药物的开发提出了新的挑战。目前已有报道证明ESX-1分泌系统可以作为抗结核药物筛选的靶标，为抗结核新药开发提供了新的途径和思路。ESX-1分泌系统是结核分枝杆菌在巨噬细胞内生存的必要条件。EspB是通过ESX-1系统分泌的重要毒力因子，是结核分枝杆菌维持其毒力所必需的。已有研究显示EspB在调节和介导ESX-1系统的EsxA分泌方面扮演重要的角色，但目前对于EspB参与EsxA/B转运过程的具体机制并不清楚。本项目基于EspB的结构生物学信息，揭示了EspB七聚体形成的结构基础，阐明了EspB介导EsxA/B转运的分子机制，进而影响结核分枝杆菌毒力和致病性。1）通过解析EspB七聚体和单体结构，发现EspB各功能结构域以及影响七聚体形成的关键氨基酸。EspB三维结构分为两部分，N-端形成底物分泌通道，由7个螺旋管组成，在两个相邻的亚单位界面上存在一个拉链结构，通过氢键和电子相互作用促进七聚体形成；C-端形成一个塞子结构，存在一个Ca2+碗结构，通过Ca2+结合和分离影响相邻亚单位氨基酸之间的相互作用调控通道的开合；2）通过构建体外突变体验证各结构域功能和关键突变点对七聚体形成的影响。结果表明C-端截短体EspB1-348丧失与Ca2+结合的能力，通道将处于关闭状态；任意相邻亚单位作用界面上参与拉链形成的相关氨基酸的突变均不能观察到明显理化性质的变化，只有同时突变，才能破坏聚体结构形成，说明拉链结构对于EspB七聚体的形成至关重要。3）体内验证各突变体对底物分泌情况的影响。C-末端截短体和组成界面拉链的关键氨基酸突变体回补均不能恢复底物的正常分泌。综上，EspB形成七聚体通道结构是EsxA/B转运所必需的，N-端形成转运通道，其中拉链结构是EspB七聚体结构形成的基础，C-端拥有Ca2+碗结构，能够结合Ca2+，是该通道的调节开关。以上结果阐释了EspB影响结核分枝杆菌毒力和致病性的分子机制，为基于EspB 的结核新药开发提供理论基础。